摘要 研究了用蒸发光散射检测器检测，快速分离柱高效液相色谱法测定烟草中茄呢醇的方法。烟草样品中的茄呢醇用环己烷提取，然后以ZORBAX Stable Bound (4.6´ 10 mm, 1.8 mm) C₁₈ 快速分离柱为固定相，甲醇-四氢呋喃为流动相分离，蒸发光散射检测器检测；样品中的茄呢醇在0.8 min 内可达到基线分离。方法标准回收率为90~ 101%，RSD为0.38 ~ 2.8%。用该方法测定了烟草样品中的茄呢醇，结果满意。
关键词 高效液相色谱法，蒸发光散射检测器，烟草，茄呢醇

1 引言
    茄呢醇是一种聚异戊二烯醇，是茄科植物烟草烟叶中富含的主要萜类化合物之一。茄呢醇本身具有抗菌、消炎和止血作用，而且是合成维生素K₂和辅酶Q₁₀的主要中间体，还可以作为抗溃疡药物、抗癌药物的合成原料，具有很高的药用价值。茄呢醇在烟叶中的含量比较大；而且茄呢醇对烟气中的苯并[a]芘贡献较大，对卷烟烟气安全性不利，因此准确测定烟草中的茄呢醇具有重要的现实意义^[1，2]。
    目前高效液相色谱法是测定茄呢醇的主要方法，但是分析时间普遍较长，一般超过10 min ^[3，4]；为了缩短分析时间，我们研究了用快速分离柱高效液相色谱测定烟草中茄呢醇的方法，样品中的茄呢醇在0.8 min 内可达到基线分离，和常规液相色谱相比大大节约了分析时间，是目前所见报道测定茄呢醇分离时间最短的方法。
    由于茄呢醇无紫外吸收，传统的液相色谱法普遍采用示差折光(RID)检测，但RID基于色谱流出物光折射率的变化来连续检测样品浓度，要求恒温、恒流速，对工作环境要求较苛刻，无法进行梯度洗脱，且检测灵敏度不高。因此本方法还研究了用蒸发光散射检测器(ELSD)检测烟草样品中的茄呢醇；(ELSD)是一种质量检测器，基于不挥发的样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比而进行检测，对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及产生末端紫外吸收的物质均能产生响应 ^[5]。结果表明，ELSD稳定性好，灵敏度高，适宜于烟草中茄呢醇的检测。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
　　　Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统，包括四元梯度泵，Empower色谱工作站，ELSD 2000 蒸发光散射检测器 (美国Waters公司)；Milli-Q50高纯水处理器（美国Millipore公司）；茄呢醇标准品(Sigma 公司，纯度>99%)，正己烷、甲醇、四氢呋喃均为色谱纯试剂（Fisher公司）。实验用水为高纯水。
　　用正己烷配制质量浓度均为5 g/L的茄呢醇标准储备溶液，使用前用水稀释成所需浓度的标准工作溶液。
2.2 色谱条件
    色谱柱：ZORBAX Stable Bound (4.6´ 10 mm, 1.8 mm)；流动相为甲醇-四氢呋喃(90/10)，流速为2.0 ml/min；柱温为25 ℃；进样量5 mL；ELSD的漂移管温度80℃，氮气作载气，流速2.00 L/min。在该条件下茄呢醇标样及烟草样品的色谱图见图1所示。

图1 标样(b)和烟草样品(a)色谱图

2.3 样品处理
    供试品溶液制备烟叶40 ~ 50 ℃烘干，粉碎后过80目筛，测定时准确称取样品1.0 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，加入正己烷 40 mL，50 ℃超声浸取30 min，浸取液过滤，定容到50 mL；取约1.0 mL的溶液用0.45 mm 微孔滤膜过滤，进样5.0 mL 测定作为供试品溶液。

3 结果与讨论
3.1 色谱条件的优化
    为了显著缩短分离时间，我们研究了用ZORBAX Stable Bound C₁₈ 快速分离柱为固定相分离样品中的茄呢醇，试验了三种规格的色谱柱，样品中的茄呢醇均能完全分离，但用(4.6´ 50 mm, 1.8 mm)的柱要1.8 min，(4.6´ 20 mm, 1.8 mm)的柱要1.2 min，而用(4.6´ 10 mm, 1.8 mm)的柱只需0.8 min，因此实验选用ZORBAX Stable Bound C₁₈ (4.6´ 10 mm, 1.8 mm)色谱柱分离。
    茄呢醇极性小，用反相色谱分离时一般采用非水流动相，试验了用甲醇和四氢呋喃为流动相分离茄呢醇。综合考虑分离效果、分析时间等因素，甲醇-四氢呋喃比例为90：10时效果最佳，因此本文选择甲醇-四氢呋喃(90/10)的体系作为流动相。
   漂移管温度和载气流速是ELSD检测器的两个重要参数 ^[5]。漂移管温度影响检测器的响应，温度升高，流动相蒸发趋于完全，信噪比上升，但温度过高，可能导致组分部分汽化，信号响应值变小。雾化载气流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响检测器的响应。信噪比随流速的增加而升高。本文选择漂移管温度为80℃，氮气作载气，流速2.00 L/min，可达到最小的噪声信号，色谱图基线平稳。
3.2 样品预处理条件的选择
   茄呢醇是一种聚异戊二烯醇化合物，极性较小，在小极性溶剂中具有较好的溶解度，因此实验选用小极性溶剂提取样品中的茄呢醇，几种常用溶剂的提取效果为：正己烷 > 环己烷 » 石油醚 > 二氯甲烷，因此实验选用正己烷为提取溶剂。试验了加热回流提取、超声浸取和振荡浸取三种方法提取烟草中的茄呢醇，加热回流提取操作麻烦，而在相同时间内超声浸取茄呢醇溶出率明显高于振荡浸取，因此实验选用超声浸取；在室温下茄呢醇溶出较慢，加热可加快茄呢醇的溶出，试验表明在50℃左右的水裕中超声浸取 25 min 以上烟草中的茄呢醇可完全溶出(残渣再浸取一次浸取液中未检出茄呢醇。试验选用在50℃水浴中浸取30 min。提取液用0.45 mm 微孔滤膜过滤后可直接进样分析。
3.3 方法的线性范围、检出限、回收率和精密度　
    将浓度为10 mg/L、40 mg/L、120 mg/L、800 mg/L、1600 mg/L、4000 mg/L的各系列标准茄呢醇溶液，在测定条件下进样5 mL，对茄呢醇的绝对量为0.1 mg、0.4 mg、1.2 mg、8.0mg、16.0 mg、40.0 mg。根据ELSD测得的峰面积A（单位：mV. S）对应茄呢醇的绝对进样量C（单位：mg）进行线性回归，得到曲线方程。结果表明：茄呢醇含量在0.1- 400 mg/mL 内成良好的线性关系，回归方程为：A = 8.67×10⁵ C–648，r = 0.9998。
    将最小质量浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样5 mL，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的质量浓度以确定检出限。结果表明最低检测限为 20 ng/mL。
   在3个浓度水平做加标回收率实验，每次样品准确称取0.5 g，加标量分别为：0.5 mg，0.2 mg和0.05 mg，按2.3方法处理，处理液中加入标准的浓度分别为：10 mg/mL，4 mg/mL和1 mg/mL，在选定的色谱条件下测定，依据加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，结果见表-1。结果表明方法回收率高。

表1 方法标准回收率

    取烟草样品5分，按实验方法每样平行测定5次，方法相对标准偏差（RSD）在1.9-2.4%之间，说明该方法精密度好。

3.4 实际样品分析
    烟草样品每样平行测定5次，每次测定取相同的样品两份，其中一份样品中加入0.5 mg茄呢醇标样，另一份不加，按本文2.3样品处理方法测定，依据加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，5次平行测定的结果计算相对标准偏差，结果见表2。

表2 样品分析及结果