De Novo drug design of anti-cancer drug imatinib's analogues

Li Shunlai, Wang Jun, Li Xiuyan, Du Hongguang
( School of Science, Institution of Modern Medicine, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)

Abstract Based on the crystal structure of Imatinib and tyrosine kinase complex (PDB ID: 2HYY), the active structure and pharmacophores of imatinib, and the interaction between imatinib and the active site of tyrosine kinase have been explored. It was found that the methylpiperazin group of imatinib bound to the active site of tyrosine kinase weaker than other substructure, and there are no important pharmacophores, so this part structure of imatinib can be rebuilt. Further molecular design of anti-cancer drug imatinib's analogues was carried out by De Novo Drug Design method, 199 molecules were obtained at first, and 10 molecules with high score were screened by docking software, this research results shows that imatinib's analogues with potential for effective tyrosine kinase inhibitors..
KeyWords anti-cancer drug; imatinib; analogue; De Novo drug design

抗癌药物伊马替尼衍生物的从头分子设计研究

李顺来 王军 李秀艳 杜洪光
（北京化工大学理学院，现代药物研究所，北京100029）

摘要 本文对酪氨酸激酶和伊马替尼复合物晶体的结构(PDB ID: 2HYY)中伊马替尼的活性结构、药效团以及伊马替尼与酪氨酸激酶作用方式进行了分析研究，表明伊马替尼分子结构中哌嗪基部分与酶作用较弱，没有重要的药效团，适合在此部分结构进行结构改造；在此基础上进行了伊马替尼衍生物的初步从头分子设计研究，设计出了199个分子，并用对接软件从中筛选出10个打分较高的分子，表明伊马替尼衍生物成为酪氨酸激酶抑制剂具有可行性。
关键词 抗癌药物；伊马替尼；衍生物；从头分子设计

1 引言
   诺华(Novartis)公司的抗癌药物格列卫(Gleevec，Glivec)，通用名称为甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)，代号为STI571，化学名为[4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-{4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基氨基]-苯基}-苯甲酰胺甲磺酸盐。其化学结构如图1所示。

图1 伊马替尼的结构式
Fig.1 Structure of imatinib

    伊马替尼是酪氨酸激酶抑制剂类药物，2001年5月10日，伊马替尼口服胶囊制剂以具有突破性的抗肿瘤机制进入美国FDA特快审批通道，用于a-干扰素给药失败胚细胞危象病期、慢性病期、加速病期的粒细胞白血病治疗用药。伊马替尼的诞生过程可谓药物开发的又一典范^[1]。该药作为通过“关闭”一种可使细胞具有癌变与增殖能力的酪氨酸激酶而起到抗癌作用。
    每年全球约有4500例慢性脊髓性白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)患者，并且有23000例带病存活者。上个世纪60年代，Nowell与Hungerford发现CML患者与白血细胞中含有一种异常的费城(Philadelphia)染色体相关^[2-3]。随后，80年代，Witte等^[4-5]发现，这种费城染色体上编码了一种特异的激酶基因，即BCR-ABL基因，在患者体内产生BCR-ABL激酶，这种激酶通过催化底物的磷酰化，在细胞内传递信号，激发患者髓系细胞增殖，导致CML。90年代初^[6-8]， Zimermann等合成了一系列以2-苯氨基嘧啶为主体的小分子化合物。经过筛选，发现CGP5714B，也就是STI571在体外能够抑制PDGFR酪氨酸激酶^[9]，后来进一步证明这种小分子能够特异性的抑制BCR-ABL的活性^[10]。由于伊马替尼的出色疗效，当年就被《Science》评为2001年世界10大科技突破之一^[11]。
    然而近年临床方面的研究表明，伊马替尼出现了耐药现象，寻找其它酪氨酸激酶抑制剂成为抗癌药物新的研究方向，特别是对伊马替尼进行结构改造和修饰。本文对伊马替尼活性结构、药效团以及伊马替尼与酪氨酸激酶作用方式进行研究，并尝试采用计算机辅助药物分子设计方法对可能的伊马替尼衍生物进行初步从头分子设计研究，探索设计新型酪氨酸蛋白激酶小分子抑制剂抗癌药物的可行性。

2 研究方法
    本文酪氨酸激酶和伊马替尼复合物晶体的结构(PDB ID：2HYY)从蛋白质数据库(PDB)^[12]中直接下载获得。首先以LIGPLOT软件^[13] 分析研究了伊马替尼与酪氨酸激酶作用方式，接着采用LigandScout^[14]软件分析了复合物晶体(2HYY)中伊马替尼的药效团信息，最后运用LigBuilder软件^[15]和eHiTS软件^[16]，进行了酪氨酸激酶抑制剂的从头分子设计研究，主要研究步骤包括：首先对酪氨酸激酶和伊马替尼复合物晶体的三维结构进行分析，得出酪氨酸激酶活性位点的相关信息；然后采用GROW策略产生大量的候选抑制剂分子，并从中筛选出比较优秀的分子；最后用eHiTS软件将这些分子分别与酪氨酸激酶进行对接，从中选取对接能量最低的分子作为最终的研究结果。全部计算均在AMD Althon 64 X2 3600+ 电脑上完成，所有参数若非特别指明，均使用缺省值。

3 结果与讨论
3.1 酪氨酸激酶与伊马替尼复合物(2HYY)的三维结构         
    选用酪氨酸激酶与伊马替尼已有复合物的晶体结构数据(2HYY)作为原始三维结构文件，由图2可以看出晶体结构是一个四聚体结构，灰色球体分别为酪氨酸激酶的四个配体分子，四个区域各代表一个伊马替尼与酪氨酸激酶复合物。
3.2 酪氨酸激酶与伊马替尼的作用方式
    图3给出了用Ligplot软件绘出的伊马替尼与酪氨酸激酶相互作用结构图。在复合物中，伊马替尼的氨基酸序列为STI 600，由图中可以看出，在伊马替尼与酪氨酸激酶复合物中伊马替尼周围有较多氨基酸片段，其中处于活性位点的有Phe317、Leu370、Leu248、Val256、Ala269、Met318、Phe382、Tyr253、Glu286、Lys271、Thr315、Asp381、Ile313、Met290、Ile293、Val289。伊马替尼STI 600与Met318、Glu286、Asp381、Thr 315之间存在强烈的氢键作用，而与其他片段之间属于疏水相互作用。所以就伊马替尼本身结构来说，其产生氢键作用的各个官能团应当对药效所起的作用要大些，而其它产生疏水相互作用的结构部分所起的作用要小一些，但对于药物分子可以起骨架支撑作用，所以两者都有各自的药效作用。更重要的是，我们研究发现伊马替尼的哌嗪环与酶几乎没有相互作用。也据文献报道，伊马替尼在最初的合成设计中^[17-18]，分子中1-甲基哌嗪部分只是增加整个分子的水溶性，当伊马替尼与酶结合后，这部分结构位于酶催化中心的外部，因此哌嗪部分并不影响伊马替尼与酶的结合。这一发现也可以通过下面的药效团的分析得到印证。

图2 伊马替尼抑制剂与酪氨酸激酶复合物的晶体结构图
Fig.2 Crystal structure of the imatinib and tyrosine kinase complex

3.3 伊马替尼的药效团分析             
    图4给出了由伊马替尼与酪氨酸激酶相互作用的药效团的信息。其中，F1: Don和F5: Don代表氢键给体药效团；F3: Acc、F6: Acc和F7: Acc代表氢键受体药效团；F11: Aro、F8: Aro、F9: Aro和F10: Aro代表芳香环中心药效团；F2: Acc&ML代表氢键受体和金属配位键；F4: Hyd代表疏水区。


图3 伊马替尼与酪氨酸激酶相互作用结构图
Fig. 3 Structure of imatinib bound to the active site of tyrosine kinase

图4 由伊马替尼与酪氨酸激酶相互作用生成的药效团
Fig.4 Pharmacophores of imatinib generated from imatinib and tyrosine kinase complex

    由伊马替尼的药效团分析也可以看出，哌嗪环区域没有重要药效团作用，伊马替尼适合在此部分结构进行结构改造，我们推测若哌嗪环被其他基团取代后可能也会具有抑制酪氨酸激酶的活性，为此我们尝试以去掉哌嗪环后伊马替尼分子的剩余结构部分做模板进行初步的从头分子设计研究，期望有可能得到相当活性或者高活性的抑制剂分子。
3.4 伊马替尼的从分子设计过程               
    首先用POCKET程序获得酪氨酸激酶的活性口袋的信息。程序将会在结合口袋内产生关键作用位点，如图5所示，红色区域代表氢键受体位点，蓝色区域代表氢键给体位点，灰色区域代表疏水作用位点。该程序会产生两个输出文件：一个文件存储组成结合口袋的所有分子；另一个文件存储结合口袋内的所有网格。这两个文件会在随后的配体构建程序GROW中用到。
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图5 2HYY复合晶体结构中酪氨酸激酶的关键活性位点
Fig. 5 The key active site of tyrosine kinase of imatinib in 2HYY.pdb(The protein is hidden for the sake of a clear representation. The ligand is shown here for instead to illustrate the shape of the binding pocket)

    整个分析过程中，首先将源文件2HYY.pdb拆分为受体酪氨酸激.pdb和配体imatinib.pdb两个文件，然后用格式转换程序把imatinib.pdb转换为imatinib.mol2文件，并且把酪氨酸激.pdb和imatinib.mol2作为输入参数编入pocket.index，运行POCKET模块，最后得到描述受体活性口袋相关信息的文件和药效团模型的文件。
    接着利用GROW模块产生新分子。由于所研究的是酪氨酸激和配体伊马替尼的复合物的三维结构文件2HYY.pdb，所以希望从伊马替尼上面分离出“种子”结构。通过分析酪氨酸激和伊马替尼的复合结构可以发现，除了哌嗪基团的伊马替尼结构是伊马替尼的功能基团，所以选用其他部分作为运行GROW模块的“种子”结构。首先从伊马替尼.pdb文件中把哌嗪基分离出去，保存为seed.pdb文件，然后用把它转换为mol2格式的seed.mol2文件并加氢。由于前面研究已表明：哌嗪环区域没有重要药效团作用，此部分结构适合进行结构改造，为此本文初步分子设计研究将原为哌嗪基位置的氢设为“种子”(如图6结构中小球位置)，为了标记“种子”上的生长点，将对应的氢原子的类型从“H”改为“H.spc”。

图6 种子结构的结构式
Fig.6 Structure of seed compound

    最后处理新分子库，运行PROCESS模块来从中挑选出最终结果。
    利用LigBuilder的GROW模块构建出了很多个配体分子，通过分析每个目录中的索引文件，综合比较各个分子的分子量、logP的值、结合亲和力和生物利用度，从中选出了logP的值较高、结合亲和力和生物利用度较强，并且分子量较小的分子。这样选的原因是：logP的值高、分子量小的分子脂溶性强，容易穿透细胞膜和脑屏障，从而利于吸收；结合亲和力强的分子与受体蛋白的作用强，因而抑制性强；生物利用度强的分子容易合成。依照这些标准，选出了共199个分子优秀配体分子。

3.5 伊马替尼衍生物的对接评价
    为了减少今后合成和实验的工作量，本文使用eHiTS软件对优秀的配体分子进行进一步的筛选。对于选出的199个分子一一进行对接，最后选出得分最高的十个化合物，得到的十个高分分子的结构与对接能量如图7所示。

图7 10个高得分的伊马替尼衍生物
Fig.7 10 imatinib analogues with high score

    从图7可以看到这些设计出的高分伊马替尼衍生物，得分都很高，都大于伊马替尼的得分(eHiTS-Score: -7.2078)，从理论上具有比伊马替尼更高的活性。另外，对这10个高得分的伊马替尼衍生物结构分析研究发现，这些衍生物绝大多数在原来哌嗪环部位生成与苯环稠合的环，并且在环上都有羧基、羟基、羰基以及氨基等极性基团，这样一方面在此部分结构产生特定空间立体结构与酪氨酸激酶契合，另一方面通过增加与酶的氢键、疏水等新的结合作用，从而有可能提高药效，表明它们具有进一步实验研究的价值，同时本文初步分子设计研究也表明新型伊马替尼衍生物类型的抗癌药物具有可行性，笔者将作进一步更全面的从头分子设计与合成研究，以期发现结果更好又容易合成的化学结构。