Zhang Hongyi, Wen Zhihua, Chen Hui
(College of Chemistry and Environmental Science; Hebei University; Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province，Baoding 071002)

Abstract Nitrite, nitrate and thiocyanate have been quantified in non-smoker and smoker saliva by capillary zone electrophoresis (CZE), using a 20 mmol×L^-1phosphate buffer at pH 6.0 (ionic strength was adjusted to 0.0816 mol/kg with Na₂SO₄) as a running buffer. The proteins and enzymes in saliva sample were removed by centrifugation and filtration of the mixture of acetonitrile and saliva sample. Bromate was selected as the internal standard because it was impossibly present in original saliva and it did not interfered with the selected three anions. Linearity of the ratio of peak areas for analyte and internal standard against analyte concentration was observed from 0.01 to 1. 00 mmol× L^-1 with a linear coefficient of 0.999 for nitrite, from 0.10 to 6. 00 mmol×L^-1 with a linear coefficient of 0.999 for nitrate and from 0.05 to 2. 00 mmol×L^-1 with a linear coefficient of 0.999 for thiocyanate. The whole separation was achieved in less than 10 min. The simpler sample pretreatment and relatively low running cost make CZE good alternative to existing methods.
Keywords capillary electrophoresis, saliva, nitrite, nitrate, thiocyanate

2009年3月19日收稿；国家自然科学基金资助课题（20875020）

摘要 用毛细管电泳定量测定了非吸烟者和吸烟者唾液中亚硝酸盐、硝酸盐和硫氰酸盐含量，以pH值等于6.0 的20 mmol×L^-1磷酸盐作背景电解质（离子强度调整为0.0816 mol/kg Na₂SO₄）。将等体积的乙腈和唾液混合，然后通过离心和过滤的方法除去唾液样本中的蛋白质和酶。溴酸盐因为不可能存在于原始的唾液中，并且不干扰所选择的三种离子的分离，因此被选为内标物。对于亚硝酸盐浓度在0.01到1.00 mmol×L^-1范围内呈校正峰面积与浓度间线性相关系数大于0.999，对于硝酸盐浓度在0.10到6.00 mmol×L^-1范围内呈校正峰面积与浓度间线性相关系数大于0.999，对于硫氰酸盐浓度在0.05到2.00 mmol×L^-1范围内呈校正峰面积与浓度间线性相关系数大于0.999。整个电泳分离过程在十分钟内完成。本文的方法因其简单的样品处理过程和相对低的运行费用，为唾液中这些离子的测定提供了一种可供选择的方法。
关键词 毛细管电泳 唾液 亚硝酸根 硝酸根 硫氰酸盐

1 引言
    口腔唾液是一种复杂的混合物,不仅含有各种蛋白质、DNA、RNA等大分子以及多种微生物^[1]，而且含有脂肪酸和一些常见的无机离子等^[2]。唾液可反映出人体健康状况，近年来有关唾液成分的分析检测的研究越来越多^[1,3]。与血样相比，唾液采集安全方便、无创伤、无血源性疾病传播的危险、患者无痛苦。与尿样相比，唾液可实时采样^[1]。
    唾液中硝酸盐、亚硝酸盐的代谢及其功能越来越引起人们的关注,一方面它们是致癌物N-亚硝基胺的前体物质，与上消化道恶性肿瘤有关；另一方面它们在一定浓度范围内起抗真菌作用^[4]。烟雾中的氰化物在肝脏解毒生成硫氰酸盐，唾液中硫氰酸盐含量可作为被动吸烟受害与否的依据^[5]。因此建立一种快速、经济、准确的测定唾液中硝酸盐、亚硝酸盐和硫氰酸盐的分析方法是十分必要的。
   目前国内测定唾液中这三种物质的方法有：单扫描示波极谱法^[6]、催化动力学法^[7]、镉柱法^[8]、高效液相色谱法^[8]等。这些方法或者只能分析一个组分，或者操作步骤繁琐。近年国外学者提出了用毛细管电泳分析检测唾液中这三种物质的思路。Tanaka等^[9]用毛细管区带电泳法（CZE）在涂层毛细管上实现了唾液中的硝酸盐，亚硝酸盐，硫氰酸盐及尿酸分离分析。此方法需要比较复杂的毛细管柱涂层处理步骤。Gaspar等^[10]用CZE在空管毛细管上实现了唾液中硝酸盐、亚硝酸盐的分离检测，但是为了避免Cl^-的干扰，不能选择灵敏度较高的200 nm检测，只能选择检测灵敏度较低的214 nm。
   本文在文献基础上，建立了一种测定上述三种离子的毛细管区带电泳法（CZE），详细考察了背景电解质溶液浓度、背景电解质溶液pH以及分离电压的影响，在背景电解质溶液中添加了调节离子强度的硫酸盐，采用乙腈沉淀法去除唾液中的蛋白质，选用较长的毛细管电泳并辅以一定的气压，在十分钟内实现了上述三种离子的测定，而且避免了Cl^-的干扰。

2 实验部分
2.1仪器
    P/ACE MDQ毛细管电泳系统(Beckman Coulter Inc.Chino.CA)，PDA－紫外检测器和32Karat数据处理软件；仪器最大允许电压30kV；石英毛细管，总长60.2cm，有效长度50cm，内径75mm(河北永年光导纤维厂）；分析天平（SHIMADZU AUY120）；KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
    新毛细管用0.1 mol/L的氢氧化钠冲洗30 min，然后用水冲洗10 min，最后用缓冲液冲2 min。运行期间用缓冲液冲洗2 min。
2.2 试剂与溶液
    亚硝酸钠、硝酸钾、磷酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、硫氰酸铵、溴酸钾均为分析纯，乙腈为色谱纯。
    分别配制10 mmol/L硝酸盐、亚硝酸盐、硫氰酸盐及溴酸盐储备液，用时稀释到所需浓度；配制5 mol/L和1 mol/L氢氧化钠溶液，用于调节pH；配制1 mol/L磷酸储备液。
2.3 样品的处理
    采集唾液样品，移取一定体积到离心管，加入等体积乙腈，在涡旋混匀器上混匀，然后在离心机离心5分钟（4000 r/min）。取适量上层清液，经0.45mm有机滤膜过滤，滤液直接进样分析。

3 结果与讨论
3.1 缓冲液pH的影响
    这些要测定的阴离子的极限电泳淌度值大于所选实验条件下的电渗流，所以要从负极端进样，检测器靠近正极端。由于硝酸根与亚硝酸根的质量与表面电荷的比值较为接近，因此硝酸根与亚硝酸根的分离是重点要考察的。由于亚硝酸是一种弱酸，背景电解质溶液pH变化，可以影响亚硝酸的型体分布系数，进而可调节亚硝酸根的表面电荷多少。通过添加Na₂SO₄保持离子强度为0.0816，配制了pH从3到8的6种背景电解质溶液。实验发现，当pH < 4时，硝酸根离子比亚硝酸根离子电泳速度快，先到达检测器；当pH〉4时，亚硝酸根先于硝酸根到达检测器。亚硝酸根与硝酸根迁移顺序在pH=4附近出现的更迭现象，可以通过我们以前得到的经验公式加以预测，可计算出当pH=4.1时才有：

    式中q为有效电荷数，MW为分子量。当pH < 4.1时左式〉右式，硝酸根首先到达检测器；而当pH〉4.1时左式<右式，亚硝酸根首先到达检测器。
    另外pH对分离度和时间也有影响。在pH4时能够基本的分离，但是分离度不高。当pH值达到6以上，能实现很好的分离（R＞1.5）。随着背景电解质溶液pH值越大，阴离子出峰时间在逐渐延长。当pH=8分析时间在13分钟以上。本实验选择最佳pH为6。
3.2 缓冲液浓度的影响
    配制浓度在分别为10、20、30、40、50 mmol/L的磷酸盐背景电解质溶液，pH均为6，加入Na₂SO₄调解离子强度均为0.0816。 考察了这些背景电解质溶液对分离的影响，实验结果如图1所示。随着磷酸盐浓度增大，迁移时间逐渐增加，分离度无明显的变化。下面实验选择了20 mmol/L的磷酸盐。

图1 不同浓度背景缓冲液硝酸盐和亚硝酸盐的电泳图
Fig.1 Electropherograms of nitrite and nitrate at different concentrations of background solutions
分离条件：温度20℃，分离电压-20kV， 0.3psi的压力进样10s，
198nm直接紫外检测。a-e 分别为含10、20、30、40、50mM的磷酸盐背景
电解质（加入硫酸钠）。硝酸盐和亚硝酸盐的浓度为0.01 mmol/L

图2 氯离子对分离无干扰的证据
Fig.2 Evidence of no interference from chloride
分离条件：温度20℃，分离电压-25kV， 0.3psi的压力进样10s，
198nm直接紫外检测。20 mmol/L的磷酸盐背景电解质（含19.7mM硫酸钠）。
亚硝酸根0.10 mmol/L,硝酸根2.00 mmol/L，硫氰酸根0.50 mmol/L，溴酸根0.04 mmol/L

表1 标准物质的线性数据
Table 1 Linear data obtained from the standard solutions

3.7样品的测定
    对七名健康志愿者，采集唾液样品，按照实验部分介绍的方法处理，在最佳电泳条件下进行分析，其测定结果如表2：

表2 样品中的硝酸盐，亚硝酸盐及硫氰酸盐的测定结果
Table 2 Analytical results of nitrite ,nitrate and thiocyanate

    原唾液中各离子的实际浓度：亚硝酸根平均为0.24 mmol/L（11.3mg/mL），硝酸根平均为1.89 mmol/L (117.2mg/mL)，硫氰酸根平均为0.36 mmol/L之间(21.1 mg/mL)。结果与文献基本一致，属正常唾液。实验结果表明，唾液中硫氰酸根含量吸烟者 > 被动吸烟的人 > 不吸烟人。通过戒烟前后硫氰酸盐的测定，为评价戒烟效果提供了一种简单实用的方法。
3.8 加标回收率实验
    取一定体积的唾液，按照实验部分的方法进行处理，移取1.3mL 4份滤液（样品瓶），然后加入不同体积的三种标准物质，补充不同体积的水，使体积相等。加入20mL，10 mmol/L的内标，测定回收率，均在90%-109%之间。

表3 硝酸盐、亚硝酸盐和硫氰酸盐的添加回收率数据
Table 3 Recovery data of Nitrate、Nitrite and Thiocyanate

4 结论
   本文所建立的毛细管电泳法可同时实现唾液中硝酸根、亚硝酸根和硫氰酸根的分离检测，样品中的氯离子对测定不产生干扰，通过乙腈处理样品可有效消除唾液酶，采用内标法可实现待测离子的准确定量。方法简单、成本低廉、样品消耗少，为今后进一步研究唾液中无机离子生理作用以及唾液中这些离子的日常检测，提供了一种可供选择的方法。

REFERENCES
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[4] 夏登胜,王松灵.北京口腔医学，2005，13(1): 75.
[5] Yang P, Wei W, Tao C. Analytica Chimica Acta, 2007, 585(2): 331.
[6] 田秋霖,刘丽娜,朱友家,等.卫生研究,1997，26(1): 41.
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