Enantioseparations in non-aqueous media of chiral pharmaceuticals by pressurized capillary electrochromatography

Kang Lei, Gao Ruyu, Yao Chuanyi^#,Yan Chao^#
(State Key Laboratory, Institute of Element-Organic Chemistry, Nankai University, TianJin 300071, China; ^#Unimicro Technologies Corporation, Ltd., TEDA, Tianjian 300457, China)

Abstract  The enantioseparations of four chiral drugs such as promethazine, carteolol, celiprolol, and salbutamol were tested on TriSep^TM-2000 CEC system by using vancomycin as chiral stationary phase in non-aqueous media by pressurized capillary electrochromatography (pCEC). The effects of eletrical field strength, pressure, and composition of mobile phase on enantioseparations were studied with promethazine as model solute. A mathematical model describing the relationship of capacity factor and selectivity with electrical field strength, pressurized flow velocity, electroosmotic mobility, and electrophoretic mobility is established, which is used to simulate and explain the experimental data.
Keywords Pressurized capillary electrochromatography, Chiral separation, Chiral stationary phase, Vancomycin

在非水相体系中加压毛细管电色谱分离手性药物

康蕾，高如瑜^*, 姚传义^#，阎超^#
（南开大学元素有机化学研究所，国家重点实验室，天津，300071;  ^#天润通微分析技术有限公司，天津，300457）

摘要 在TriSep^TM-2000GV电色谱仪上，以万古霉素为手性固定相，研究了非水相体系下加压毛细管电色谱对手性药物异丙嗪、噻利洛尔、卡替洛尔和沙丁醇胺的分离；考察了电场强度、压力、流动相对手性分离的影响；探讨了分离参数、电渗淌度和电泳淌度与容量因子、选择性因子的定量关系。
关键词 加压毛细管电色谱，手性分离，手性固定相，万古霉素

    手性药物对映体通常具有不同的生理活性，因此，手性药物的分离分析倍受人们关注。毛细管电色谱(CEC)是综合了高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)的优点而发展起来的一种新型微分离技术，具有高效、高选择性、高灵敏度和快速的特点，已经成为手性分离的一个强有力的工具。HPLC上的绝大多数手性固定相如环糊精、蛋白质、纤维素、Pirkle型等^[1,2]如今已经成功的用于CEC的手性分离。
    大环抗生素是一种新型的手性固定相，分子中通常具有多个手性中心和手性空腔，还有多种可以和手性物质作用的官能团，因而具有很强的手性识别能力。万古霉素是一种糖肽类大环抗生素，它的分子中含有18个手性中心和三个手性空腔，这些手性空腔可以容纳手性分子形成包合物，从而实现手性分离。Lynen^[3]和Wikstrom^[4]研究小组分别以万古霉素作为手性固定相在CEC上分离了手性药物。
    当前，CEC手性分离主要是在商用电泳仪或自制设备上实现的，在实际操作中往往会遇到气泡问题。气泡对于CEC来说是致命的，一旦出现气泡，基线的噪音会增强，最终会导致电流中断，实验被迫中断。天润通微分析技术有限公司研制出了世界上第一台专用电色谱仪TriSep^TM-2000GV，在该体系中，流动相由泵压力流和电渗流(EOF)共同驱动，色谱柱两端加压，克服了气泡问题，实现了加压毛细管电色谱(PCEC)的分离模式。
    实验所用流动相体系为非水相体系（或极性有机模式），流动相中含有大量的极性有机溶剂以及微量的冰醋酸和三乙胺用来改善柱效和分离度。采用非水相体系作为流动相可以减少焦耳热、促进疏水性组分的溶解、调节选择性。
    本文以大环抗生素万古霉素作为手性固定相，在TriSep^TM-2000GV加压电色谱仪上，在非水相体系中分离了手性药物异丙嗪、噻利洛尔、卡替洛尔、沙丁醇胺；研究了电场强度、压力、流动相对手性分离的影响，探讨了加压毛细管电色谱的保留机理和手性识别机理。

1.2 样品与试剂
    手性药物样品：1. 异丙嗪；2. 噻利洛尔；3. 卡替洛尔；4.沙丁醇胺 为天津药检所赠。
    试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，流动相和样品在使用前用0.22mm的纤维素酯膜过滤，超声波脱气。
1.3 色谱条件
    手性毛细管填充柱150mm（ID）×20cm(优尼特通微技术有限公司)，总长30cm，填料粒度5mm；样品用甲醇溶解，浓度约200mg/L；所用流动相为甲醇/三乙胺/冰醋酸=100/0.1/0.1（v/v/v）；线性流速0.3 - 1.7mm/s； 电场强度50 - 250V/cm；反压阀200 - 1000psi； 检测波长254nm；温度为室温；进样量10nL。

2 结果与讨论      
2.1 手性药物的PCEC分离
    手性药物异丙嗪为抗心率失常药，噻利洛尔和卡替洛尔均为b-阻滞剂，沙丁醇胺为止咳平喘的呼吸系统药，它们均属市场上急需，并以外消旋体销售的手性药物。关于它们的手性拆分在HPLC和CE上均有报道^[6-8]，在CEC上的手性拆分还未见报道。
    以大环抗生素万古霉素作为手性固定相，甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1（V/V/V）作为流动相，四种手性药物上得到分离，其中异丙嗪、卡替洛尔、噻利洛尔得到了基线分离，结果详见图2-1-1和表2-1-1。
表2-1-1 四种手性药物在PCEC上的分离

图2-1-1 四种手性药物在PCEC上的分离谱图
A 异丙嗪 B 噻利洛尔 C 卡替洛尔 D 沙丁醇胺
流动相：甲醇/三乙胺/冰醋酸=100/0.1/0.1(V/V/V)；泵流速：0.02ml/min；
泵压力：18kg/cm²；反压阀：250psi；电场强度：250 V/cm；检测波长：254nm；柱温：室温

2.2 电场强度对手性分离的影响
    选择异丙嗪作为考察对象，在体系压力恒定的条件下，将电场强度从50 V/cm升高到300V/cm，研究了电场强度对异丙嗪手性分离的影响，结果见图2-2-1，从图中可以观察到，随着电场强度的升高，柱效和分离度都有一定程度的改善。这是由于在PCEC中，流动相是由电渗流和压力流共同驱动的，由于电渗流和压力流的流型不同，使得塞子型的电渗流可以获得比抛物线型的压力流更高的柱效，而随着电场强度的升高，电渗流逐渐增大，此时，电渗流在驱动流动相方面的贡献也逐渐增大，从而导致柱效和分离度的提高。
    选择甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1（V/V/V）的体系来研究电场强度对容量因子、选择性因子的影响。将电场强度从50 V/cm升高到300V/cm，由硫脲的保留时间(t₀)、异丙嗪对映体的保留时间(t_R)计算得到相应的容量因子k’，该值即为实验k’值，由该k’可以计算得到异丙嗪对映体的选择性因子a，即为实验a值。以实验值k’ V_S E作图2-2-2，以实验值a V_S E作图2-2-2，从图中可以看到，随着电场强度的增大，异丙嗪对映体的容量因子k’减小，而选择性因子a则逐渐增大。下面，通过建立一个数学方程来研究容量因子k’、 选择性因子a与电场强度之间的函数关系。

图2-2-1 在PCEC中电场强度对柱效、分离度的影响 异丙嗪第一个对映体的塔板高▲，分离度◆ 流动相：甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1（V/V/V）泵流速：0.02ml/min；泵压力：18kg/cm2；反压阀：250psi；电场强度：250V/cm；检测波长：254nm；柱温：室温

图2-2-2 在PCEC中电场强度对容量因子、选择性因子的影响
A 异丙嗪第二个对映体（理论值◆ 实验值◇）；异丙嗪第一个对映体(理论值▲ 实验值△)
B 异丙嗪对映体(理论值◆ 实验值◇)
流动相：甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1（V/V/V）
泵流速：0.02ml/min；泵压力：18kg/cm²；反压阀：250psi；
电场强度：250V/cm；检测波长：254nm；柱温：室温

    下式表示被分析物质Q在固定相和流动相之间达到的分配平衡：
Q_mQ_s (1)
K_P=[Q]_s/[Q]_m    (2)
此处，“s ”和“m”分别代表固定相和流动相，K_P为Q在两相间的平衡常数，对于PCEC体系，Q的线性速度可以表示为^[36]：
v_m=v_pres+v_eo+v_ep (3)
v_eo=m_eoE (4)
v_ep=m_epE       (5)
v_pres、v_eo和v_ep分别表示压力流、电渗流和电泳力对线性流速的贡献。m_eo和m_ep分别表示电渗淌度和电泳淌度。而Q的平均线速度v可以表示为：
  (6)
L_e是色谱柱的有效长度，t_R是Q的保留时间，V_m 和 V_s是流动相和固定相在柱中所占的体积，由等式(2)和(6)可以得到：
(7)
此处，k₀’ 定义为
(8)
b (=V_m/V_s)是色谱柱中的相比。
对于不保留的中性物质，将m_ep=0 、 k₀'=0代入等式(7)，得到：
(9)
Q在PCEC中的容量因子可以表示为：
(10)
    选择甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1的体系，将硫脲的保留时间(t₀)及相应的E代入到方程(9)，计算得到该体系下v_pres=1.92 cm/min，m_eo=6.4×10 ^–5 cm²/v/s。将异丙嗪的保留时间(t_R)、相应的E值及计算得到的v_pres和m_eo代入到方程(7)，可以算得，。
    将异丙嗪对映体的k₀’、v_pres、m _eo、m _ep代入到方程(10)，计算得到k’与E的函数关系式，将电场强度从50V/cm升高到300V/cm，可以算得相应的容量因子k’，此值即为k’理论值，将理论值k’ V_S E作图2-2-2，图中，实线代表的是理论值，虚线代表的是实验值，从图2-2-2中可以看到，理论值和实验值能很好的吻合，由此，可以得出这样的结论：对于碱性物质异丙嗪而言，它的容量因子k’随电场强度E的增大而减小。
    Q在PCEC中的选择性因子可以表示为下式：
(11)
    将异丙嗪对映体的k₀’、v_pres、m_eo、m_ep代入到方程(14)，计算得到a与E的函数关系式，从而算得与电场强度相对应的a，此值即为a理论值，将理论值aV_S E作图2-2-2，图中，实线代表的是理论值，虚线代表的是实验值，从图2-2-2中可以看到，理论值和实验值能很好的吻合，由此，可以得出这样的结论：对于碱性物质异丙嗪而言，选择性因子a随电场强度的增大而增大。
2.3 压力对柱效、分离度的影响
    在PCEC中，流动相的线性速度是由电渗流和压力共同决定的。当其它条件不变时（电场强度、流动相、色谱柱），色谱柱两端的压力差决定着柱内流动相的流速。因此，可以通过改变反压阀来改变压力从而改变流动相的线性速度。这样，就可以通过流动相线性流速的变化来研究压力对手性分离的影响。
    选异丙嗪作为研究对象，流动相体系固定为甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1，电场强度为250V/cm，以硫脲作为不保留标记物，则硫脲的保留时间为死时间t₀，流动相的线性速度可以用下式表示：

    在PCEC模式下，改变反压阀的大小，流动相的线性流速相应的随之变化，以P V_S H作图2-3-1，从图中可以观察到，硫脲的塔板高度要高于异丙嗪的第一个对映体，这可能是因为异丙嗪的扩散系数比较小的缘故。当反压阀从1000psi降到200psi，流动相线性流速从1.7mm/s降到0.33mm/s，异丙嗪的塔板高度也由70mm降到了18mm，硫脲的塔板高度由150mm降到了84mm。由此可见，当压力减小时，流动相流速减小时，柱效增加。这是因为随着流速的降低，流动相中低柱效的抛物线型压力流所占比重减小，高柱效的塞子型电渗流所占比重增大，溶质在流动相中的扩散减小，最终导致柱效的提高。
    以压力P对分离度R_s和选择性因子a作图2-3-1，从图中可以看到，当压力减小时，流动相流速增大时，分离度有所降低，且a随流速的增大而减小。
    考虑到流动相的线性流速对异丙嗪柱效、分离度、选择性因子的影响，选择流动相线性流速较低时对手性分离有利，因此，选择反压阀为250psi(u=0.47mm/s)作为实验的优化压力，我们在万古霉素手性柱上进行的所有研究都是在250psi反压阀下进行的。

图2-3-1 在PCEC中压力对柱效、分离度、选择性因子的影响
A 硫脲△ 异丙嗪第一个对映体◇
B 异丙嗪对映体
分离度◇ 选择性△
流动相：甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1（V/V/V）
泵流速：0.02ml/min；泵压力：18kg/cm²；柱温：室温
电场强度：250V/cm；反压阀：250psi；检测波长：254nm；
2.4 流动相对手性分离的影响
    以异丙嗪作为研究对象，改变流动相中甲醇、乙腈的比例及改变冰醋酸和三乙胺的浓度，研究了流动相对容量因子、选择性因子、柱效和分离度的影响，实验结果列于表2-4-1

表2-4-1 流动相对异丙嗪选择性、分离度、柱效的影响

    从表中可以看到：当冰醋酸和三乙胺的浓度恒定时，改变有机相中甲醇与乙腈的比例：随着甲醇含量的增大，异丙嗪的保留因子k’变小，选择性a增大，柱效和分离度也增大。这是因为甲醇分子中含有醇羟基，它在手性分离过程中起到三方面作用：通过与万古霉素手性识别剂手性空腔中的羟基、氨基等官能团发生氢键作用，从而与溶质分子争夺手性空腔；通过氢键作用与手性空腔及溶质分子三者之间形成三元包合物；溶质与固定相硅羟基之间的非选择性氢键作用由于甲醇的介入而减弱。
    甲醇的上述作用使溶质被更快的洗脱出来，保留因子减小，选择性提高，溶质在固定相中的扩散减小，从而使柱效和分离度都有所提高。
    保持甲醇和乙腈的比例恒定，随着冰醋酸和三乙胺浓度按比例的增大，异丙嗪的保留因子降低，分离度和柱效降低，选择性没有太大的变化。
    这是因为当冰醋酸的浓度加大时，醋酸根离子更易于与异丙嗪（带正电物质）结合形成离子对，这样使溶质被更快的洗脱下来，使溶质的保留因子降低，但因为异丙嗪对映体的保留因子是同比例降低的，因此对映体的选择性保持不变；当冰醋酸和三乙胺的浓度按比例增加时，流动相的离子强度会变大，则双电层厚度加大，电渗流变小，塞子型的电渗流在流动相中所占的比重下降，导致柱效和分离度的降低。
    保持流动相中甲醇和乙腈的比例恒定，增大三乙胺的浓度而降低冰醋酸的浓度，异丙嗪对映体的保留因子增大，选择性和分离度减小，柱效增大。
    冰醋酸在手性分离中可以与异丙嗪（带正电物质）结合形成离子对，使对映体的洗脱速度增大，保留因子变小；与异丙嗪及手性空腔（含有离子化官能团）结合形成三元包合物，使对映体的选择性增大。当冰醋酸的浓度降低时，上述两种作用均变小，从而使溶质的保留因子增加，异丙嗪对映体的选择性降低。
    三乙胺作为碱可以促进柱子内壁和固定相表面硅羟基的电离，这样会导致电渗流增大，使塞子型电渗流在流动相中所占比重加大，最终导致柱效增大。而作为柱效和选择性综合作用结果的分离度则降低。
    综合考虑流动相对异丙嗪对映体保留因子、选择性、柱效和分离度的影响，选取甲醇/冰醋酸/三乙胺=100/0.1/0.1（V/V/V）的体系作为优化流动相体系。

3 结论
    以大环抗生素万古霉素作为手性固定相，在TriSep^TM-2000GV加压电色谱仪上，在非水相体系中分离了手性药物异丙嗪、噻利洛尔、卡替洛尔、沙丁醇胺；并以异丙嗪作为考察对象，研究了电场强度、压力、流动相对手性分离的影响，研究发现：较高的电场强度、较小的压力和流动相中甲醇含量较高的条件有利于对映体分离；探讨了电场强度、压力流速等分离参数及电渗淌度和电泳淌度与容量因子、选择性因子的定量关系，发现：随着电场强度的增大，异丙嗪的容量因子减小，选择性因子逐渐增大。

REFERENCES       
[1] Wistuba D, Schurig V. J. Chromatogr. A., 2000, 875 (1/2): 255.
[2] Dermaux A, Sandra P. Electrophoresis, 1999, 20: 3027.
[3] Dermaux A, Lynen F. J. High. Resol. Chromatogr., 1998, 21 (10): 575.
[4] Wikstrom H, Svensson LA. J. Chromatogr. A., 2000, 869 (1/2): 395.
[5] Rui J Z, Zou H F. J. Pharm. Anal (in Chinese)., 1999, 19 (1): 64.
[6] Jelinek I, Dohnal J, Snopek J. J. Chromatogr. A., 1989, 464 (1/2): 139.
[7] Stalcup A M, Gahm K H. Anal. Chem., 1996, 68: 1360.
[8] Tanaka Y. J. High. Resol. Chromatogr., 1996, 19: 421.

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