http://www.chemistrymag.org/cji/2004/063018pc.htm |
Mar.21,
2004 Vol.6 No.3 P.18 Copyright |
Li Renqiang, Jiang Fengyi, Chen Yao#,
Ma Aineng, Fang Ling
(Department of Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; #Department
of Chemistry, Jinan University, Guangzhou 510632, China)
Abstract Based on that most water soluble
vitamins and the hemin possess absorption spectra in far-ultraviolet or in visible region,
respectively, the structural stability of vitamin molecules and the hemin state were
measured using spectral scan to probe the interaction between these organic molecules
after they were mixed. Results: The interaction between hemin and vitamin B6,
nicotinic acid, biotin could not be detected, but molecular structure of vitamin C was
destroyed by hemin, one coordinate ligand of iron in hemin was found to connect to vitamin
B1 or folic acid molecule and some interactions between pantothenate and hemin
happened.
Keywords Hemin, Water soluble vitamins, Interaction between organic molecules,
Absorption spectral scan
血红素与水溶性维生素相互作用的研究
李任强，江凤仪，陈瑶#，马霭能，方玲（暨南大学生物工程学系，广州 510632；#暨南大学化学系，广州 510632）
2003
年12月28日收稿；教育部留学回国人员科研基金（2002-247）资助项目。摘要
利用多数水溶性维生素在紫外光区域、血红素在可见光区域有光吸收的特征，通过光谱扫描的方法等研究了主要的水溶性维生素分子与血红素分子接触后这些维生素分子结构的变化和血红素状态的变化，探讨了它们之间的相互作用。结果表明：血红素与维生素B6、烟酸、生物素等相互间几乎无作用，维生素C分子结构可被血红素破坏，血红素分子中的铁的一个配位键与维生素B1或叶酸分子发生了连结，泛酸分子与血红素之间也存在有一定的相互作用。关键词 血红素 水溶性维生素 有机分子相互作用 光吸收扫描
血红素是生物体中许多蛋白质分子的辅助成分，如血红蛋白、细胞色素类蛋白质、肌红蛋白、过氧化物酶等分子中都含有血红素。当这些蛋白质在体内进行代谢降解，会产生游离的血红素分子。由铁与卟啉环络合，铁处在血红素分子中央，存在有二个未配位的配位键，且铁能发生二价与三价铁互变，所以，血红素具有进行氧化还原化学反应的特性，极易与一些物质，特别是含氮物质发生化学反应，即具有极强的攻击性。其对细胞、酶分子等的毒害作用早已被人们认识。
虽然在正常条件下，血液中的血液结合素、血清白蛋白等能与游离的血红素结合来降低它的活泼性，并将其输送到肝脏进行分解或重新利用[1，2]，但游离血红素的毒害作用，特别是非正常代谢状态下由其所引起的毒害作用已引起人们的普遍关注。是否这种高活泼性的物质对人体中一些功能有机分子如维生素类物质会起攻击作用呢？这方面的研究未见报道。为此，我们对血红素与主要的水溶性维生素之间的化学反应等进行了研究。显然，这对有机化学、营养学以及代谢的研究等都具有极大意义。
要进行这样的研究，首先要解决如何鉴定血红素分子与有机分子之间是否发生反应这个问题。因为要从反应体系中把维生素分子与血红素分离相当困难，只能在共存的条件下进行测定。水溶性维生素大多数在远紫外光吸收区域都有吸收峰，而氧化态血红素在此区域的光吸收值不大，通过此区域光吸收曲线的比较，包括曲线的相减等方法，可判断与血红素混在一起的维生素分子的结构是否发生了变化。另外，多数水溶性维生素无色，而不管是氧化态还是还原态血红素在可见光区域都有明显特征的光吸收峰，如果血红素能与维生素等分子发生化学反应，其状态就发生了变化，必然反映在光吸收曲线的变化上。所以，我们采取了光吸收扫描和对扫描曲线的处理等方法来判断血红素与维生素分子之间是否发生了化学反应。对于血红素状态与光吸收曲线之间的关系的解读，我们还用一些辅助性实验来验证。在本研究中，我们对维生素B1、B2、B6、叶酸、泛酸、烟酸、生物素以及维生素C等主要的水溶性维生素与血红素之间的化学反应进行了测定分析，对一些化学反应的机理进行了探讨，并就此研究的相关问题进行了讨论。
1.1 药品与仪器
生化试剂维生素B1、B2（核黄素）、B6（盐酸吡哆辛）、叶酸、D-泛酸钙、烟酸、D-生物素及氯化血红素均购自上海伯奥公司，维生素C为分析纯。用于光吸收光谱扫描的仪器为上海棱光S54型紫外可见分光光度计。
1.2 实验方法
分别配制浓度为0.02%的各种维生素及血红素溶液。叶酸先用数滴稀NaOH液溶解后定容，核黄素先用数滴稀HCl液溶解后定容，血红素先用数滴2N氨水溶解后定容。其余均用水溶解定容。测定各样品的pH值，测定在450-650nm区域的光吸收曲线，稀释适当倍数后测定在230-370nm区域的光吸收曲线。
配制终浓度都为0.02%的血红素与各单种维生素的混合物，如血红素与维生素C，血红素与维生素B1等的混合物。在混合物中，由于血红素分子量大，维生素分子数要多于血红素分子数。将各混合物置于40℃水浴10分钟，降至室温后测定各样品的pH值，与上述一样进行紫外和可见光区域的光扫描测定，并同时加少许连二亚硫酸钠固体于比色杯中，翻匀，使氧化态的血红素变成还原态，测定处于还原态时血红素在450-650nm区域的光吸收曲线。由于血红素与维生素B2混合后产生沉淀，故放弃对维生素B2的测定。 2 结果与分析
2.1 维生素B6、烟酸、生物素的稳定性
对这几种维生素分子与血红素混合后在紫外及可见光区域的光吸收曲线进行比较及相关处理后发现，维生素分子结构及血红素状态都没有发生变化，说明血红素对它们不起作用或作用极弱。
2.2 维生素C的变化
维生素C及其与血红素混合后的pH分别为3.1和5.3，都处于酸性。它们在紫外区域的光吸收曲线如图1。由图1可见，当维生素C与血红素混合时，结构并不马上被破坏，但在3小时后，原来在250nm处的吸收峰完全消失，维生素C分子结构被完全破坏（在330nm后的吸收峰值为血红素所致）。用稀NaOH调节维生素C液pH到6.1，该峰虽有移动但一直稳定成峰，所以，该结构的破坏完全是由于血红素所致。
图1 维生素C与血红素反应前后在紫外光区的光吸收曲线
虚线：维生素C 细线：维生素C与血红素刚反应后
粗线：维生素C与血红素反应后3小时
2.3
维生素B1、叶酸与血红素的反应维生素B1与叶酸分别与血红素混合后在紫外光区的光吸收曲线与单纯维生素时的曲线有差异，但经测定，它们之间的差异完全是由于pH的变化所引起。也就是说，维生素B1与叶酸的分子结构不由于血红素的存在而破坏。
但在可见光区域，虽然氧化态的血红素在混合前后的状态差异不大，但处在还原态时则有明显的差异，即混合后，还原态血红素的光吸收曲线前移（图2）。我们推测是血红素的铁以一个配位键与维生素分子中的氮原子发生了连结。为了验证，据蛋白质中组氨酸的咪唑基的氮能与血红素中的铁成键的现象，将含0.01%血红素和0.10%组氨酸的混合物在60℃保温10分钟后冷却，并以亮氨酸代替组氨酸做对照，测定它们在可见光区域的还原态血红素的光吸收曲线。与组氨酸混合后的血红素的曲线发生前移（图3），而以亮氨酸代替组氨酸的对照并无此特征（曲线不列出）。所以，由图2、图3的结果说明血红素分子以铁的一个配位键与维生素B1或叶酸分子发生了连结，成为一个整体。也就是说，虽然维生素B1或叶酸的分子结构不被血红素所破坏，但它们能与血红素发生反应形成复合物，也就失去了原来的性质。
图2
血红素与维生素B1、叶酸反应前后在可见光区的还原态的光吸收曲线A-血红素与与维生素B1 虚线：血红素 粗线：与维生素B1反应后的血红素 细线：粗线减去虚线
B-血红素与叶酸 虚线：血红素 实线：与叶酸反应后的血红素
虚线：血红素 实线：与组氨酸反应后的血红素 2.4 泛酸钙的变化
泛酸钙在紫外与可见光区域都无吸收峰，且不随着酸碱度的不同而使光吸收特性变化，所以，血红素与其混合后氧化态时表现的光吸收特征说明它们之间发生了一定的反应（图4）。但还原态时血红素的状态无任何变化，说明血红素铁并不参与成键，可能是血红素分子卟啉环上的活性基团如丙酸基与泛酸发生了作用，或是在血红素的攻击下，泛酸分子发生了较大的变化，也使血红素分子的状态发生了一定的变化。
图4
血红素与泛酸钙反应前后在可见光区的氧化态的光吸收曲线
细线：血红素与泛酸钙反应后 粗线：血红素
当分子的结构发生变化后，其吸收光谱也即发生变化。利用吸收光谱来检测物质的结构变化是常用的也是重要的手段。由于大多数水溶性维生素主要在远紫外光区，而血红素主要在可见光区有特征吸收光谱，故在此研究中，我们利用这显著的差别测定了各种水溶性维生素与血红素混合前后维生素分子与血红素分子的光谱特征。在去除了由于酸碱度改变引起光谱变化的影响后，以光谱的变化来表征或判断物质的变化即表征或判断维生素分子与血红素分子之间的反应。实验结果显示了一些维生素分子与血红素分子相互之间能起反应，另一些维生素分子则不与血红素反应而保持稳定。虽然血红素具有极高的活泼性和极强攻击性，但其对有机分子的攻击显然是有选择性的，这主要还是取决于这些有机分子自身的结构和特性。维生素C是一较强的还原剂，与具有氧化还原作用的血红素混合后，发生氧化还原反应的可能性较大。维生素C分子被氧化破坏是一个渐变过程[3]，本实验中维生素C与血红素接触后不马上被破坏说明维生素C分子的变化是被血红素氧化的结果，而维生素C分子变化的历程则是一个相当复杂的过程[3，4]。从维生素C、血红素的分子结构、特性等来看，它们之间的“直接”作用可能性很小，因为此反应中，血红素状态不变，而维生素C是一“缓慢”变化的过程。可能是由于在血红素、光的存在下，在体系中首先产生氧自由基，然后对维生素C产生氧化从而使维生素C变化，因为血红素中铁的价位变化容易引起氧自由基的产生[5]。
维生素B1分子是一个含氮杂环并带有硫原子和氨基的分子，一个分子中共有4个氮原子，应该说是一个极性强、相当活泼的物质。维生素B6和烟酸都是一个只含一个氮原子的杂环衍生物，显然结构相当稳定。生物素分子虽然含有硫原子，但其稳定的骈环结构可能降低了氮和硫原子的活泼性。所以，从分子结构性质上分析，血红素分子中的铁的未配位键更易与维生素B1分子中的氮或硫原子发生连结，实验结果也证明了这一点。但血红素分子的铁到底与维生素B1分子中哪个原子连结则还无法判断。叶酸分子同样是含多个氮原子的有机大分子，其第5、第10位氮能与一碳单位共价相连[6]，估计血红素分子中铁的一个配位键是与这二位氮原子的其中一位相连。泛酸的分子量相对较小，有一氮原子，实验结果表明血红素与其接触后，氧化态的血红素的状态发生了一定的变化，但很难从理论上分析它们之间的化学反应。这需要做更多的深入研究。 4．结论
血红素对维生素B6、烟酸、生物素等有机分子基本无反应，不起破坏作用。血红素能破坏维生素C的分子结构，但反应不是瞬间完成。血红素分子以铁的一个配位键与维生素B1或叶酸连结，形成复合物，显然使这二种维生素分子性质发生改变。泛酸与血红素之间存在有一定的相互作用。 REFERENCES
[1] Grinberg L N, O'Brien P J, Hrkal Z. Free Radical Biology & Medicine, 1999, 26 (1/2): 214-219.
[2] Peters JR T. All about Albumin. California: Academic Press, Inc., 1996: 234-240.
[3] Tianjin Light Industry College, Wuxi Light Industry College. Food Biochemistry (Shipin Shengwu Huaxue). Beijing: Light Industry Press,1989: 382.
[4] Li R Q, Jiang F Y, Fang L et al. Science and Technology of Food Industry (Shipin Gongye Keji), 2002, 11: 32-34.
[5] Yuan Q S. Modern Enzymology (Xiandai Meixue). Shanghai: East China Science and Engineering University Press, 2001: 292.
[6] Garrett R H, Grisham C M. Biochemistry, Second Edition. Beijing: Higher Education Press, 2002: 602.