Electrophoretic behaviors of a new amino-reactive derivatization reagent's derivative and its preliminary application

Abstract The electrophoretic behaviors of a new amino-reactive fluorescent labeling reagent and its derivatives were studied in detail. The preliminary application of SAMF in the determination of amino acids by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection and its feasibility was also discussed.
Keywords Amino-reactive fluorescent labeling reagent; electrophoretic behaviors; laser-induced fluorescence detection

新氨基荧光衍生试剂衍生物电泳行为的研究及其应用初探

曹丽伟
(暨南大学化学系，广东 广州510632)

2005年11月11日收稿；暨南大学引进人才基金资助项目（No. 51205060）

摘要 研究了新氨基荧光衍生试剂6－氧－（N－琥珀酰亚胺乙酸酯）－9－（2’－甲氧羰基）荧光素及其衍生物的毛细管电泳行为，并初步研究了毛细管电泳分离其氨基酸神经递质衍生物。讨论了该试剂在毛细管电泳分离－激光诱导荧光检测氨基化合物中的适宜性。
关键词 氨基荧光衍生试剂；电泳行为；激光诱导荧光检测

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
    Beckman MDQ 毛细管电泳仪配488nm氩离子激光诱导荧光检测器，激发波长/发射波长：488 nm /520 nm。毛细管为57cm （有效长度50 cm）´ 75 m m（内径）石英毛细管（河北永年光纤厂）。进样方式：压力注射；进样时间：0.5秒。新毛细管分别用水，1 mol l^-1 NaOH, 水, 1 mol l^-1 HCl，水活化30分钟。
    SAMF由实验室合成。SDS购自Sigma(St. Louis, MO, USA)。Brij-35 购自Fluka (Buchs, Switzerland)。实验所用的其它试剂均为分析纯，购自上海试剂公司。实验所用的水为Milli-Q system提供的超纯水(Millipore, Bedford, MA, USA)。
1.2 试剂水解产物和衍生产物的制备
    SAMF与水、氨基化合物的反应式见图1。
    试剂水解产物的制备：取l ml SAMF乙腈溶液置于10 ml容量瓶中，加入适量的pH 8.5 硼砂缓冲溶液，然后稀释至刻度，摇匀，在室温下水解20分钟。
    试剂与氨基化合物的衍生产物制备：分别取适当过量的甲胺、组胺和甘氨酸溶液，1ml SAMF乙腈溶液置于10ml容量瓶中，加入适量 pH 8.5 硼砂缓冲溶液，然后稀释至刻度，摇匀，在室温下反应20分钟。

图1 SAMF与水、氨基化合物的反应方程式
Fig. 1 The reaction of SAMF with H₂O and amino compound, respectively

2 结果与讨论
2.1 电泳缓冲溶液对SAMF衍生物电泳行为的影响
   电泳缓冲溶液组成（如电解质浓度、pH值、添加剂等）不仅影响电渗流（EOF），亦影响样品溶质的电泳行为，决定着电泳分离效率、选择性、分离度的好坏，以及分析时间的长短，在CE分离优化中具有较大的意义[7]。因此，在这里我们对这些因素进行了系统的研究。
    生物胺和氨基酸是两类重要的氨基化合物，其中组胺和甘氨酸是两种较为常见的且具有重要的生理作用的化合物，也是分析检测的重要对象。研究表明，食品中过量的生物胺能引起人体中毒，甘氨酸是脑内最重要的抑制性氨基酸神经递质[8,9]。因此我们选择组胺和甘氨酸作为代表化合物，研究了各种分离条件对SAMF衍生物电泳行为的影响。
2.1.1 背景电解质浓度的影响   
    硼酸盐是毛细管电泳中常用的背景电解质，与其它电解质相比，在较高浓度下产生的电流和焦耳热相对较小，有利于电泳分离。以硼酸为背景电解质，研究了缓冲溶液浓度对SAMF衍生物电泳行为的影响。在恒定pH下，随着浓度的增加，电流逐渐增大，淌度则不断减小（图2A所示）。由图可知，SAMF-His与SAMF水解物（AMF）、SAMF－Gly两者的淌度差别一直较大，SAMF-His的电泳峰得到好的分离；但AMF、SAMF－Gly两峰的分离受硼酸盐浓度的影响较大。当硼酸为1´ 10^-2mol l^-1时，AMF与SAMF－Gly的峰完全重叠；当硼酸为2´ 10^-2mol l^-1时，两者还没有完全分离；当硼酸为3´ 10^-2mol l^-1时，两者得到完全分离。由此可见，缓冲溶液浓度对分离度的影响较明显。若要分离SAMF氨基酸衍生物，为了排除SAMF水解峰的干扰，需要较高浓度的背景电解质。
2.1.2电泳缓冲溶液pH值的影响    
    由于磷酸盐缓冲溶液的缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），因此以磷酸盐为缓冲体系，我们试验了pH在1.6－12范围内对三者淌度的影响(图2B)。实验发现，当pH小于4时，三种物质的出峰时间很长，在30分钟内仍未出峰。当pH等于4时，AMF和SAMF-Gly迁移时间仍然较长，分别为25.9和26.3分钟，两峰并未完全分离，峰形宽且矮。pH在4-10之间时，增大pH导致短的迁移时间，但是当pH值大于10以后，继续增加其pH值只会延长迁移时间，减小淌度。这可能是由于溶液pH强烈地影响熔硅毛细管的表面特性和Si-OH基的电离引起的。
    由图2B可知，SAMF-His与AMF、SAMF－Gly两者的淌度差别较大，在pH4-12之间，都能得到好的分离。而SAMF水解物（AMF）与SAMF－Gly的峰在pH8-11之间时，分离情况较好。鉴于pH对迁移率和分离度较大的影响，严格控制电泳缓冲溶液的pH值在分离SAMF衍生物中起着至关重要的作用。

图2 （A）硼酸浓度（B）pH值对迁移率的影响
(◆) SAMF-His; (< ) SAMF-Gly; (▲) AMF.
分离电压: 20 kV; 毛细管温度: 25° C; 进样时间 5 s; 进样压力34.5 mbar.
Fig 2 The effect of boric acid concentration (A) and pH (B) on the mobility.

2.1.3 缓冲溶液添加剂的影响           
    电泳分离中常用的添加剂有表面活性剂、有机溶剂等。表面活性剂按其分子结构可分为离子型（阳离子、阴离子、两性离子）和非离子型的两大类。我们分别研究了这几类物质的加入对SAMF衍生物的电泳行为的影响。
    以SDS为代表，研究了阴离子表面活性剂对电泳行为的影响。SDS的临界胶束浓度（CMC）为8.1´ 10^-3mol l^-1。由图3A可见，加入SDS后，迁移时间明显延长，淌度大大降低。当SDS浓度接近CMC后，再继续增加其浓度，迁移时间和淌度的变化趋势不如以前明显。当SDS浓度小于1´ 10^-2mol l^-1时，SAMF－Gly和AMF的电泳峰重叠或者没有完全分离，随着SDS浓度的增加，两者的分离度也增加。此外，SDS对三种物质的出峰顺序也影响较大。在未加入SDS时，出峰顺序为SAMF-His、SAMF－Gly、AMF。在加入SDS后，出峰顺序刚好相反。
    十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）是一种分子表面活性部分带正电荷的阳离子表面活性剂。实验发现，加入低浓度的DTAB即能显著地影响分析物的迁移时间和淌度。虽然DTAB的CMC为7´ 10^-2mol l^-1，但是当浓度为1´ 10^-2mol l^-1时，三种物质在30分钟内仍未出峰。这可能是由于DATB的含量对EOF的大小甚至方向都有影响。与SDS不同的是，DTAB的加入并不改变三种物质的出峰顺序。图3B显示了DTAB在1´ 10^-3－5´ 10^-3mol l^-1范围内对淌度的影响。
    聚氧乙烯（23）十二醇（Brij35）是一种常用的非离子型表面活性剂。加入了Brij35后，出峰顺序并没有改变。由图3C可知，Brij35浓度的改变对三者淌度的影响一直较大。
    在上述三种表面活性剂中，表面活性剂浓度的增加均导致试剂及衍生物淌度的减小，其中DTAB浓度的变化对淌度的影响最大。从分离效果来看，SDS的加入引起出峰顺序的改变，对这三种物质的分离影响也较大。因此，在以后的CE-LIF分离SAMF衍生物中，若想通过加入表面活性剂来改善分离，首先应考虑加入SDS。
    在CE中，有机溶剂作为一种改性剂，常常加到缓冲溶液中，以改变熔硅管内壁和缓冲溶液性能[10]。常用的溶剂有醇类、乙腈、丙酮等。在这里我们分别选用了甲醇和乙腈作为有机添加剂研究其对衍生物电泳行为的影响。随着有机溶剂含量的增加，EOF速度降低，离子迁移时间加长，淌度降低，分离得到改善。与甲醇相比，乙腈含量的变化对迁移时间和淌度的影响相对较小。实验发现，当乙腈浓度高于30%（v: v）时，峰形较难看，电流也不稳定。可见加入一定量的乙腈有利于电泳分离，而浓度较高时，对分离不利。

图3 表面活性剂浓度对迁移率的影响. (A) SDS; (B) DTAB; (C) Brij-35.
(◆) SAMF-His; (< )SAMF-Gly; (▲) AMF
分离电压: 20 kV; 毛细管温度: 25° C; 进样时间 5 s; 进样压力34.5 mbar.
Fig.3 The effect of (A) SDS, (B) DTAB and (C) Brij-35 content on the mobility.

图4 不同毛细管温度下的电泳图 1, SAMF-His; 2, SAMF-Gly; 3, AMF
电泳缓冲溶液: 硼酸 4´ 10^-2mol l^-1, pH=6.0; 分离电压: 20 kV; 进样时间 5 s; 进样压力34.5 mbar.
Fig.4 Electropherogram at different capillary temperature.

2.2柱温、分离电压对SAMF衍生物电泳行为的影响
    研究了15－50° C的柱温对SAMF衍生物的电泳行为的影响。图4显示了不同温度下的电泳图。图谱清楚地表明，随着温度的升高，迁移时间明显缩短，分离度也随之降低。显然，温度对迁移时间的影响是电渗流迁移率m _eo随温度升高而增大的结果。由此可见，在分离SAMF衍生物时，应严格控制毛细管的温度，保证实验的重现性。另外，在选择合适的温度时，应从分析时间、分离度、样品适合存放时间和温度控制的方便程度这几个方面综合考虑。
    试验了电压在5-30kV之间时SAMF衍生物的电泳行为。增加电压能有效地增加淌度，但分离选择性也有所降低，产生的电流和热量也较大。因此，应该使用尽可能高的电压以达到最大柱效、最高分离度和最短的分析时间。
2.3 SAMF衍生物的稳定性研究
    将SAMF组胺和甘氨酸衍生物在不同温度下放置不同时间后进行电泳分析，观察电泳峰的情况。研究表明，在室温时，衍生物峰在48小时内均有良好的重现性，峰面积仅下降8%。在4° C时，在48小时内，峰面积的改变也很小，下降率小于6.5%。如果将它们贮存在-30° C下，四个月内峰面积基本不变。由此可见，通过在荧光素的母体结构上进行修饰，SAMF衍生物具有良好的稳定性。
2.4 毛细管电泳分离SAMF氨基酸神经递质衍生物的初步研究
    以SAMF作为氨基酸神经递质类的衍生试剂，初步研究了SAMF与常见的七种氨基酸神经递质衍生物的毛细管电泳分离条件。七种衍生物在11分钟内完全分离(如图5所示)。在以后的工作中，我们将进一步优化它们的衍生和分离条件，并应用于实际样品的测定。

图5 SAMF氨基酸神经递质衍生物的毛细管电泳分离图 1.AHA, 2.GABA, 3.Gln, 4.Ala, 5.Gly, 6.Glu, 7.Asp.
电泳缓冲溶液: 硼酸 4´ 10^-2mol l^-1, pH=6.0; 电压: 15 kV; 毛细管温度: 25°C; 进样时间5 s; 进样压力34.5 mbar.
Fig. 5 Electropherogram of AMF and amino acid derivatives.

3 结论
    本文研究并讨论了新合成的荧光试剂SAMF氨基衍生物的毛细管电泳行为。结果表明，SAMF衍生物在毛细管电泳分离中稳定性好，干扰较少，较易得到分离。以SAMF氨基酸神经递质衍生物为分离对象，初步证明了SAMF作为标记试剂在毛细管电泳分离－488nm激光诱导荧光检测氨基化合物中的适宜性，为以后进一步将SAMF用于该方法分析氨基化合物的研究奠定了基础。