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Mar. 12, 2006 Vol.8 No.3 P.21 Copyright |
Liu Tianqing a,b, Guo Rong b
(a School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Jinagsu,
210093, b School of Chemistry and Chemical Engineering, Yangzhou University,
Yangzhou 225002)
Abstract The interaction of Hb
with acyclovir and the effects of SDS on the behaviors of Hb in Hb/acyclovir/H2O
system in low SDS concentration are studied by the methods of UV spectrum and
fluorescence, conductivity, zeta potential and negative-staining TEM. The results obtained
show that acyclovir can quench the Hb fluorescence. An Hb molecule associates with 1.32
acyclovir molecules to form a complex. With SDS concentration increasing in Hb/acyclovir/H2O
system, the intrinsic fluorescence and synchronous fluorescence of Hb and the conductivity
all increase but the zeta potential decreases. The Hb morphology structure tends to be
loose and incompact. When SDS concentration is more than 1×10-6 mol/L, the
structure is unfolded completely.
Keywords hemoglobin; SDS; acyclovir; behavior; interaction
(a南京大学化学化工学院，南京 210093; b扬州大学化学化工学院，扬州 225002)
2006年1月12日收稿；国家自然科学基金
(No. 20573091，20233010)资助项目.摘要 运用光谱法、电化学方法和蛋白质负染-电镜等方法研究了低SDS浓度下SDS对Hb/acyclovir/H2O体系中Hb特性的影响。结果表明，acyclovir对Hb有猝灭作用。在Hb/acyclovir/H2O体系中，随着SDS浓度增加，Hb特性荧光和同步荧光强度都增加，zeta电位下降，体系的电导率增加。Hb结构松散。当SDS浓度增加到1´ 10-6 mol/L时，蛋白结构已近完全被打开，发生了明显的变性。
关键词 血红蛋白，SDS，阿昔洛韦，特性，相互作用
血红蛋白(Hb)是人体中的重要蛋白之一，其主要生理功能是在体内输送氧气，把氧输送到体内各组织[4-6]。它是由四条多肽链组成的──二条a链和二条b链，每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe2+不被氧化[7,8]。阿昔洛韦(9-(2-羟乙氧甲基)鸟嘌呤，acyclovir)，广谱抗病毒药，体外对单纯性疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒等具抑制作用。它对病毒有特殊的亲和力，但服用后对人体会产生某些不良反应如贫血等[9]，其机理仍不清楚。
阴离子表面活性剂SDS能使蛋白变性[10-13]，但蛋白变性前后的结构形貌及电学性质的变化较少被研究。通常人们研究蛋白的变性形多为在较高的变性剂浓度下进行，但在较低变性剂(如SDS)浓度下，变性剂对蛋白性质的影响报道较少[14-16]。药物对蛋白的性质有一定的影响，但在有药物存在的蛋白体系中，变性剂SDS对蛋白性质、作用影响又如何，其报道也很少。刘媛等人研究认为药物三七总皂甙对牛血清白蛋白溶液构象能产生一定的影响[17]。我们已用电化学方法和荧光探针法等研究了氨基酸对十二烷基硫酸钠(SDS)胶束聚集性能的影响[18]。本文用光谱法、电化学方法和蛋白质负染-电镜等方法研究低表面活性剂浓度下阿昔洛韦与Hb间相互作用特别是药物存在时SDS对Hb特性的影响，为表面活性剂在药剂学、生命科学中的应用提供理论依据和新的研究方法。
1 实验部分
1.1药品
血红蛋白（生物试剂，上海丽珠东风生物技术有限公司），阿昔洛韦（原料药，99%，湖北潜江制药股份有限公司）。十二烷基硫酸钠(SDS，PT公司生产，上海试剂厂进口分装，在无水乙醇中重结晶提纯两次)。水为二次蒸馏水。
1.2 实验方法
1.2.1 紫外-可见吸收光谱的测定
样品的紫外
1.2.2 荧光光谱的测定
激发波长为280nm，测定不同组成的Hb荧光光谱(RF-5301型荧光光谱仪，日本Shimadzu公司)。在同样条件下，分别测定固定激发波长和入射波长差为Dl =15nm、Dl =60nm时Hb的同步荧光光谱。激发、发射狭缝宽度均为3nm。
1.2.3 电导率的测定
体系的电导率由DDS-11A型电导率仪(上海雷磁仪器厂)测定。电导率仪已经0.01mol× L-1 KCl溶液校正。
1.2.4 Hb的ζ电位测定
蛋白分子一般具有较大尺寸和一定的电荷，在电场作用下呈现电泳现象[14]。配制一系列含有Hb的溶液，在JS-94H型微电泳仪（上海中晨仪器有限公司）配合计算机分析和计算，可获得Hb的动电位(zeta电位)。测量条件：电压10-30 V，稳定时间5min，测量间隔时间为50s。连续测定5次，取其平均值。测量误差< ± 0.2mV。
1.2.5蛋白形貌分析--负染-电镜法
由于生物及有机物都是由轻元素组成，为了克服其在电镜观察时图像反差很小的缺点，常用负染技术观察其形貌[19]。将含有蛋白的样品滴在具有Formvar膜的载网上。样品在Formvar膜上吸附15-20分钟后，在Formvar膜上滴加负染液(PTA)。1-2分钟后，用滤纸吸去多余的染液，在台灯下烘干。由TECNAIR透射电镜(Philip Apparatus Co.，USA)观察蛋白质的形貌。
以上实验均在25oC条件下进行。
2 结果与讨论
2.1 Acyclovir对蛋白性质的影响
大多数蛋白在276nm波长附近有一个吸收峰，此峰主要是由肽链上色氨酸(Trp)残基的吲哚环和酪氨酸(Tyr)残基的苯环 p ® p*跃迁引起的。血红蛋白在406nm、500nm和630nm处均也出现明显吸收峰[14]
(图1)。406nm对应高铁血红蛋白(metHb)特征吸收峰，高铁血色原(hemichrome)的特征吸收峰为406nm和535nm [20]。576 nm为氧合血红蛋白(oxyHb) 的吸收峰[14,21]，630nm吸收峰为血红素和高铁血红蛋白的特征吸收峰。
在Hb/H2O体系中加入acyclovir，Hb的紫外光谱在波长300nm-700nm范围内基本没有发生变化(图1)，表明acyclovir对metHb、hemichrome结构及含量几乎没有影响。但在263nm处出现1小的吸收峰，此峰可能是Acyclovir与Hb结合形成复合物的复合物所致。从图1还可看出，随着acyclovir浓度增加，Hb在276nm处的紫外吸收峰明显增强。在蛋白质分子中，生色基团的分布不同，其微环境也不同。微环境的性质是由蛋白质分子的构象所决定的。构象改变，则微环境随之改变；微环境改变，则生色基团的紫外吸收光谱也随之改变。通过氢键和疏水作用，Acyclovir作用、吸附于Hb表面。Acyclovir浓度越大，吸附、作用于Hb表面上acyclovir的量越多，Hb在276 nm处紫外吸收强度增加。另一方面，acyclovir可能与Hb作用后，形成复合物，改变了Hb的微环境，使得Hb在276 nm处紫外吸收强度也增加。
Acyclovir在252nm处的特征吸收峰A252随其浓度的增加而线性增加(图1 中右上图)，当acyclovir浓度增加到5´ 10-6
mol× L-1时，A252随acyclovir浓度增加的幅度增大，这可能是由于蛋白对acyclovir的诱导作用使得acyclovir的环境发生变化。蛋白的二级结构也被打开，导致A252增强。
图1 Acyclovir对Hb紫外光谱的影响
Figure 1 UV spectra of acyclovir-Hb
system vary with acyclovir concentration
CHb (mol× L-1): 2×10-6; CA(mol× L-1):
1-1×10-6, 2-2×10-6, 3-4×10-6, 4-1×10-5,
5-2×10-5, 6-5×10-5
Hb的荧光特征峰为333.6nm。在Hb溶液中加入acyclovir，Hb荧光峰强减小(图2)，acyclovir对Hb有明显的猝灭作用。
图2 Acyclovir对Hb荧光强度的影响(l
=333.6nm)
Figure 2 Intrinsic fluorescence intensity of
Hb varies with acyclovir concentration
CHb: 2×10-6 mol/L
根据Sterm-Volmer方程[22, 23]：
(1)
式中，F和F0分别为有、无猝灭剂存在时荧光物质的荧光强度，cQ为猝灭剂浓度，kq为荧光猝灭常数，t 0为无猝灭剂存在时荧光物质的荧光寿命。对动态猝灭过程，K为Sterm-Volmer常数KD；对静态猝灭过程，K为缔合常数KS。在低acyclovir浓度范围内，F0/F~
cA为一直线，从直线的斜率得K为9.565´
104 l·mol-1。对于静态猝灭过程，荧光强度与猝灭剂-荧光物质的缔合常数KS和缔合度n的关系可转换为[24]：
(2)
以lg[(F0 – F)/F-1]对lgcA作图，从直线的截距和斜率得KS和n分别为7.76´ 104 l·mol-1 和1.32，即1个蛋白分子可结合1.32个acyclovir分子形成复合物，使Hb发生静态猝灭。高效液相色谱(HPLC)也证明有新物质生成，其含量为约为8%。
2.2 SDS和蛋白的作用特性
SDS与蛋白间存在静电、氢键、亲水和疏水等相互作用[25]。在Hb体系中，随着SDS浓度的增加，荧光强度几乎线性增强(图3)；在紫外光谱中，276nm处的峰增强，630nm处峰减小，406nm峰下降并发生红移，540nm处的出现新吸收峰并增强
(图4)。SDS 对Hb 荧光增敏与蛋白质结构有关，在Hb
分子中，具有过氧化物酶活性的“血红素埋藏在疏水的空穴中，只有一边向外暴露”，SDS
的stern 层的负电荷依赖静电引力更易接近Hb，其疏水端与包围血红素的疏水空腔形成共同的疏水区，亲水端靠静电作用使血红素更加裸露[16]。由于蛋白的结构被打开、松散，所以SDS又使得蛋白容易被氧化，高铁血红蛋白容易向高铁血色原转变，最终导致血红蛋白的载氧能力减小。当SDS浓度大于1×10-5
mol/L时，Hb特性荧光和紫外光谱的变化幅度均减小。这表明在低SDS浓度范围内，SDS可能几乎全部与Hb作用。
图3 SDS对Hb荧光强度的影响(l =333.6nm)
Figure 3 Effect of SDS on the
intrinsic fluorescence intensity of Hb
●CHb: 2×10-6
mol/L; ■CHb:
2×10-6 mol/L; Cacyclovir: 1×10-4 mol/L
Hb的等电点6.5，在水中显负电性。Hb与SDS间的静电作用使得Hb与SDS不容易结合，但Hb与SDS间能依靠较强的疏水作用和氢键作用而结合[25]，导致Hb的表面净负电荷增加。另一方面，SDS能使Hb结构被打开，Hb变性，Hb的zeta电位减小。因此，随着SDS浓度的增加，Hb的负电荷增加、zeta电位下降，体系中离子的数目增加，体系的电导率增加(图5)。
图4 SDS对Hb紫外吸收强度的影响
Figure 4 Effect of SDS on the
UV-spectra of Hb
CHb:2×10-6 mol/L; CSDS(mol/L):1-1×10-6, 2-2×10-6,
3-4×10-6, 4-1×10-5, 5-2×10-5, 6-5×10-5
图5 SDS/Hb/acyclovir/H20体系中，SDS对Hb的Zeta电位和体系电导率的影响
Figure 5 Effect of SDS on the zeta
potential of Hb and system conductivity in SDS/Hb/acyclovir/H20 system
□○CHb: 2×10-6 mol/L; ■●CHb: 2×10-6 mol/L, Cacyclovir: 1×10-4
mol/L
2.3 SDS对Hb与acyclovir间相互作用的调控作用
在Hb/acyclovir/H2O体系中，随着SDS浓度的增加，276nm处的峰增强，406nm峰下降并发生红移，540nm处的出现新吸收峰并增强，630nm处峰减小(图6)，263nm处的峰消失。SDS的增加也使得Hb的特性荧光增加(图3)。但Hb的紫外、荧光的变化幅度比无acyclovir存在时要小。这些结果表明：Hb与acyclovir间具有一定的相互作用，SDS与Hb间的相互作用较Hb与acyclovir间相互作用大。当SDS浓度较大时，SDS对Hb特性的影响占主要地位。由于acyclovir与
Hb的缔合，使得Hb运动速度减小、动电位增加，电导率减小。在SDS/Hb/acyclovir/H20体系中，SDS在与Hb作用的同时，也使得原吸附或定位在Hb表面的acyclovir分子被游离开来，Hb的动电位和体系的电导率变化更显著(图5)。
图6 SDS对Hb/acyclovir/H2O体系的紫外光谱的影响
Figure 6 Effect of SDS on the
UV-spectra of SDS/Hb/acyclovir/H20 system
CHb: 2×10-6 mol/L; Cacyclovir: 1×10-4 mol/L
CSDS(mol/L): 1-1×10-6, 2-2×10-6, 3-4×10-6,
4-1×10-5, 5-2×10-5, 6-5×10-5
在蛋白的同步荧光中[26]，Dl <15nm对应于酪氨酸的光谱特征，Dl >60nm对应于色氨酸的光谱特征。随着SDS浓度的增加，Hb的同步荧光强度增加(图7)，Hb的结构被打开，氨基酸逐渐被暴露。实验中还发现：随着Hb/acyclovir/H2O体系温度升高(25oC升高到37oC)，紫外光谱和Hb的荧光强度都增加。一方面，温度增加，分子的热运动加快，分子间碰撞机会增多，动态猝灭过程增加。但另一方面，温度增加，蛋白-药的缔合物的解离度增加，静态猝灭过程减小，荧光强度增加。
图7 在SDS/Hb/acyclovir/H20体系中，SDS对蛋白的同步荧光的影响
Figure 7 Effect of SDS on the
synchronous fluorescence spectra of Hb
CHb: 2×10-6 mol/L; CSDS(mol/L): 1-1×10-6,
2-2×10-6, 3-4×10-6, 4-1×10-5, 5-2×10-5,
6-5×10-5
2.4 SDS对蛋白微结构的影响
图8为Hb在不同条件下的负染-电镜照片。从图8可以看出，acyclovir能改变Hb的结构，使得Hb的球形三级结构被更加紧密。在Hb-acyclovir体系中，在随着SDS浓度的增加，已与acyclovir相互作用的Hb结构紧密又向球形结构转变，并且球形体积逐渐增大、结构松散。当SDS浓度增加到1´ 10-6 mol/L时，蛋白结构已近完全被打开，发生了明显的变性。当SDS浓度增加到1´ 10-4 mol/L时，在电镜下很难找到完整的蛋白结构。
1
2
3
4
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7
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图8 SDS对Hb微结构的影响(负染-电镜照片)(图中左下角标尺为0.02mm)
Figure 8 Negative-staining TEM of Hb
(yardstick is 2mm)
1- CHb (mol× L-1): 1×10-5; 2-8 CHb (mol× L-1):
1×10-5; CA (mol× L-1): 1´ 10-4
CSDS (mol× L-1): 2-0, 3-1×10-7, 4-5×10-7,
5-1×10-6, 6-5×10-6, 7-1×10-5, 8-1×10-4
3. 结论
(1) 在离子型表面活性剂与蛋白作用过程中，表面活性剂对蛋白的电学特性和结构形貌等特性产生较明显的影响。SDS加入使得Hb的zeta电位下降，体系的电导率增加，Hb结构松散甚至完全被打开，发生明显的变性。
(2)在较低变性剂(如SDS)浓度下，变性剂也能对蛋白性质产生较大的影响。在药物存在时SDS仍能影响Hb的特性及相互作用行为。SDS与Hb间的相互作用较Hb与acyclovir间相互作用大。
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