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Sep.4, 2007  Vol.9 No.9 P.42 Copyright cij17logo.gif (917 bytes)

Determination of berberinehy drochloride in miniaoning particles by RP-HPLC

Bai Ligai1, Liu Haiyan1, Yang Gengliang1, 2* , Jiang Mingming1, Wang Lijuan1
(1 College of Pharmacy, Hebei University, Baoding 071002, China; 2 Molecular Science Center, Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)

Abstract Objective A method for determination the quantity of berberine hydrochloride in the MINIAONING particles by RP-HPLC was established. Method Diamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 mm) was used in the experiment. The mobile phase was the system of acetonitrile : phosphoric acid(0.1%) : glacial acetic acid : triethylamine (30:67:3:1) with flow rate of 1.0 mL·min-1. The wave length was set to 265nm. Result Regression equation of berberine hydrochloride was Y = 4.54×106x -1.08×104, r = 0.999, and the linear correlation was from 0.5 mg·mL-1 to 500 mg·mL-1. The average recovery of application sample was 99.8％. Conclusion This method was successfully applied to determine the quantity of berberine hydrochloride in the MINIAONING particles with high sensitivity and good reproducibility. Moreover, the method was very easy to perform and the results were reliable.
Keywords MINIAONING particles; Phellodendron amurense; berberinehy drochloride; RP-HPLC;

RP-HPLC法测定泌尿宁颗粒中盐酸小檗碱的含量

白立改1, 刘海燕1, 杨更亮1, 2, 姜明明1, 王利娟1
（1河北大学药学院，河北 保定 071000；2中国科学院化学研究所分子科学中心，北京 100080）

2007年6月16日收稿；国家自然科学基金资助项目（NO.20375010，20675084），河北省科技攻关项目（NO.06276479B，07276407D），中国科学院“百人计划”资助项目

摘要 目的 建立泌尿宁颗粒中小檗碱含量测定的HPLC法。方法 采用Diamonsil C18 柱（250 mm × 4.6 mm, 5 mm），以乙腈∶0.1％磷酸∶冰醋酸∶三乙胺（30∶67∶3∶1）为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长 265 nm。结果 盐酸小檗碱的线性范围为0.5-500 mg·mL-1，标准回归方程：Y = 4.54×106x - 1.08×104，r = 0.999，平均加样回收率99.8％。结论 该方法灵敏度高，重现性好，操作方便，结果可靠。
关键词 泌尿宁；黄柏；盐酸小檗碱；RP-HPLC

    泌尿宁颗粒是用于治疗泌尿系统感染的药物，具有清热通淋，利尿止痛的功效。其颗粒棕黄色，味酸甜，微苦。由柴胡，苄蓄，黄柏，桑寄生，续断，白芷，五味子，甘草，苟麻子等几味药材经一定工艺制作而成。该制剂处方组成复杂，其中黄柏主要含盐酸小檗碱等成分，盐酸小檗碱是有效成分，须严格控制其含量[1-4]。目前测定药物中盐酸小檗碱含量的主要方法有：紫外分光光度法，薄层层析－分光光度法，薄层扫描法，荧光扫描法，反相高效液相色谱法（RP-HPLC）等方法[5-9]。而泌尿宁颗粒中盐酸小檗碱含量的测定及方法学的建立尚未见报道。本文采用RP-HPLC法对成药泌尿宁颗粒中的盐酸小檗碱进行含量测定，并进行了含量测定的方法学考察。

1 实验部分
1.1 样品与试剂
    泌尿宁颗粒样品由安国制药公司提供，批号：066505，066506，066507；盐酸小檗碱对照品购自中国药品生物制品检测所（ 批号：110713-200208， 供含量测定用）；乙腈，磷酸，冰醋酸，三乙胺均为分析纯；水为三次蒸馏水。
1.2 仪器
    JASCO高效液相色谱仪系列，包括PU-1586双元泵；JASCO UV-1570紫外检测器；7725i手动进样阀；HW-2000南京千谱色谱工作站等。Sartorious BS 210S电子天平(Ma×210 g，d = 0.1 mg) ；KQ3200B型超声清洗器（ 功率250 W，率50 kHz，昆山超声仪器有限公司)。
1.3 对照品溶液制备
    精密称取干燥后的盐酸小檗碱对照品5.0 mg置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，制得盐酸小檗碱标准贮备液（500mg·mL-1）。
1.4 供试品溶液的制备
   取泌尿宁颗粒约10 g，研磨成粉末， 精密称定于100 mL容量瓶中， 加入80 mL甲醇，超声提取80分钟，然后用甲醇定容。静置，取上清液，用0.5 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。　

2 结果与讨论        
2.1 色谱分析条件的选择
   盐酸小檗碱甲醇液的最大紫外吸收波长为347 nm、265 nm和 227 nm， 在347 nm和227 nm 下杂质峰较多，故选用265 nm为检测波长。色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 mm)。分别采用乙腈－0.1％磷酸－十二烷基硫酸钠（60∶40∶ 0.1）系统和乙腈－0.1％磷酸－十二烷基硫酸钠 (50∶50∶0.1) 系统为流动相时，系统平衡时间长，色谱峰拖尾严重且分离度不高，含量检测结果误差较大。经实验筛选，当以乙腈∶0.1％磷酸∶冰醋酸∶三乙胺（30∶67∶3∶1）系统为流动相，流速1.0 mL·min-1，室温条件下，检测波长265 nm时，盐酸小檗碱得到较好的分离，峰形对称，理论塔板数以盐酸小檗碱计不低于2000，见图１。
2.2 线性关系考察
   将对照品溶液稀释，配成（0.5、10、50、100、500 mg·mL-1）一系列浓度对照品，分别取5 μL上机进样，各对照品溶液分别进样3次测定，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（x，mg）为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归计算，得回归方程：Y = 4.54×106x-1.08×104，r = 0.999，盐酸小檗碱浓度在0.5-500mg·mL-1 之间线性关系良好。
2.3 对照品精密度实验
    取同一对照品溶液，重复进样5次，测定峰面积，RSD = 0.78％。
2.4 重现性实验
    分别取同一批供试品5份，按1.3方法制备供试品溶液分别进样，测定峰面积。计算得盐酸小檗碱平均含量为0.641 mg·g-1，RSD = 0.55％。

图１高效液相色谱图
a：盐酸小檗碱对照品；b：供试品；c：阴性；
1：盐酸小檗碱峰
Fig.1 Chromatograms
a: berberine hydrochloride        b: MINIAONING sample      c: negative sample
1: peak of berberine hydrochloride

2.5 供试品含量测定
    将供试品溶液稀释5倍后，吸取5 μL上机进样。三批供试品，每批进样三次，记录峰面积，计算盐酸小檗碱稀释前的浓度，结果见表1。066505，066506，066507三批药物中盐酸小檗碱含量分别为0.653 mg·g-1， 0.639 mg·g-1， 0.629 mg·g-1。供试品色谱图见图１。泌尿宁颗粒中小檗碱平均含量为0.640 mg·g-1。根据《中国药典》2005年版一部214页“黄柏”项下规定的小檗碱含量以盐酸小檗碱（C20H18ClNO4）计，不得少于0.625 mg·g-1。因此，该制剂中盐酸小檗碱的含量符合要求。

Table 1 Results of quantity of berberine hydrochloride in sample
表1 供试品中盐酸小檗碱含量测定结果

批号
Batch number

盐酸小檗碱含量
content of berberine hydrochloride（mg·g-1）
１             ２            ３

平均含量
average content（mg·g-1）

066505

0.656

0.650

0.653

0.653

066506

0.640

0.638

0.638

0.639

066507

0.628

0.630

0.629

0.629

Table 2 Results of recovery
表2 回收率实验结果

批号
Batch number

样品含量Content
(mg)

加入量
Added
(mg)

测得量
Found
(mg)

回收率
Recovery
(%)

平均回收率
Average recovery
(%)

066505

3.27

2.54

5.78

99.5

066505

3.28

3.28

6.50

99.1

066505

3.28

3.94

7.20

99.9

066506

3.22

2.58

5.86

101.0

066506

3.22

3.22

6.53

101.5

99.8

066506

3.22

3.87

7.23

101.9

066507

3.17

2.54

5.59

98.0

066507

3.18

3.18

6.29

98.9

066507

3.17

3.81

6.86

98.2

2.6 加样回收率实验
   取同一批号的本品3份，每份约10 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，按实际样品中盐酸小檗碱含量的80%、100% 、120%精密加入盐酸小檗碱对照品的流动相溶液，按1.4方法制备，测定其含量，计算平均回收率为99.8％，RSD = 0.87%，结果见表2。
2.7 泌尿宁阴性实验
    按照处方精密称取除黄柏外的其它各种药材，按泌尿宁颗粒的提取工艺和含量测定方法分别进行提取和含量测定实验，实验表明其它成分对盐酸小檗碱的测定结果无干扰。如图1所示。

3 结论
    本实验比较了不同的流动相对泌尿宁颗粒中盐酸小檗碱的分离情况，确定了比较合适的流动相，该流动相平衡时间短，分离效果佳，便于含量测定。样品中盐酸小檗碱的含量在线性浓度范围内检测，精密度高， 重现性好， 回收率也较为理想。本实验建立了泌尿宁颗粒中盐酸小檗碱含量测定的HPLC方法学，为泌尿宁颗粒中盐酸小檗碱的含量测定提供了可供借鉴的好方法。

REFERENCES
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