Analytical application of ¹H NMR in the reaction mixtures of synthesizing the drug intermediate D-methyl xyloside

Zhang Huimin¹, Yin Jingmei ¹, Gao Dabin¹, Hu Jiehan², Zhou Guangyun¹, Jia Yingping¹
(¹Liaoning Key Laboratory of Bio-organic Chemistry, Dalian University, Dalian 116622； ²Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023)

Absract In the synthesis of D-methyl xyloside, the reaction mixture was analysized by ¹H NMR spectra to determine if the target product had been obtained and the proportion of byproducts. According to the analysis results, the reaction conditions were gradually optimized to enhance the yield, and the research process on organic synthesis was simplified.
Keywords ¹H NMR, reaction mixture, D-methyl xyloside

1H NMR在药物中间体D-甲基木糖苷合成反应混合物中的分析应用

张慧敏 尹静梅 高大彬 胡皆汉^# 周广运 贾颖萍
(大连大学生物有机化学辽宁省重点实验室，大连116622；^#中国科学院大连化学物理研究所，大连116023)

摘要 在合成D-甲基木糖苷时，用¹H NMR谱分析反应的混合物，确定是否已经获得目标产物以及各种副产物的生成，由此进一步优化反应条件，提高产率，简化了对合成过程的研究。
关键词 ¹H NMR，反应混合物，D-甲基木糖苷

1 引言      
    甲基木糖苷是合成齐多夫定，嘌呤霉素，桑吉瓦霉素等抗癌药物重要的中间体^[1,2,3]。但是由于合成D-甲基木糖苷存在立体选择性问题，副产物较多，若按照常规的有机合成方法，需先合成，再通过柱层析，重结晶等途径提纯反应混合物，然后通过对产物进行谱学研究，确定产物的结构式。这种传统的合成研究方法，不但费时费力，而且纯化后最终分析产物有可能不是所需的目标产物。为了寻找一种快速简捷的检测方法，我们考虑将¹H NMR方法应用于合成过程的研究，而不仅仅是对最终产物的分析。核磁共振不仅可以用于有机化合物结构鉴定，而且可以定量的确定一个混合物体系中各组份之间的相互比例^[4]。随着核磁共振技术的发展，¹H NMR越来越多的用于天然混合物的定量分析，如薛松等^[5,6]用¹H NMR定量确定了繁茂膜海绵中分离得到的类似的甾醇类化合物的含量，为鉴定分析组成复杂而性质相近的天然甾醇化合物提供了新思路。相比于常用的定量方法GC和HPLC来说，核磁共振的定量可用于一些平衡体系中各组份的定量，如体系顺式和反式，a和b同分异构体。因此我们在合成药物中间体D-甲基木糖苷，不经分离提纯，直接分析关键中间产物D-甲基木糖苷反应混合物的¹H NMR谱，便可知道是否已经获得目标产物以及各种副产物在混合物中所占的比例，根据分析结果，可优化反应条件，如此循序渐进，能较快地获得目标产物。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
    AV500型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；日立G - 3900 气相色谱仪(日本日立公司)；惠普6890-5973型色-质连用仪(美国惠普公司)；LABOROTA4000型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。
    D-木糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)；盐酸(分析纯，沈阳市试剂五厂)；吡啶(分析纯，中国医药公司北京采购供应站)；实验用水为二次蒸馏水。
2.2 实验方法
    样品参照文献 [7]的方法合成：将D-木糖溶解在HCl/CH₃OH溶液中恒温搅拌，反应结束后用吡啶中和至中性，减压蒸去溶剂得D-甲基木糖苷粗品。
    核磁共振仪的工作频率为500MHz ，谱宽13kHz ，数据点为32k ，脉冲角度为30°，脉冲延迟为2s ，TMS 为内标；GC条件：程序升温100 - 180 ℃，20 ℃/min ，180 ℃停留3 min；GC-MS条件：HP6890-5973色-质连用仪，电子能量70ev，离子源为电子轰击，温度为250℃，四级柱检测器温度是100℃。

3 结果与讨论
    合成D-甲基木糖苷时(图1)，首先根据文献将反应时间设为24h，HCl/CH₃OH溶液的浓度定为1% ，常温搅拌^[7]，反应结束后用吡啶中和溶液至中性，不经分离提纯直接做反应混合物的¹H NMR谱(图2，溶剂为DMSO)。图2中，d_H7.5-9.0ppm处的谱峰是吡啶引起的，d_H3.17ppm处的谱峰是甲醇产生的，d_H2.52-2.53ppm为溶剂DMSO的谱峰，其余的谱峰皆为反应混合物所产生。d_H3.36ppm，d_H3.30ppm，d_H3.26ppm，d_H3.24ppm处有四条甲氧基(-OCH₃)氢的谱峰，因为目标产物只有一个甲氧基，说明副产物较多。在这四条谱峰中，虽然其中有一条可能是来自目标产物，但因为薄层层析结果只有一个点，说明几种产物极性相近，柱层析方法很难将其分离。由此推测除1位羟基外，其它碳上的羟基也可能已经被甲氧基取代成醚(图3)，或是由其它原因所产生的。

图1 合成D-甲基木糖苷
Fig.1 Synthesis of D-methyl xyloside

图2 反应24h D-甲基木糖苷反应混合物的¹H NMR谱
Fig.2 The ¹H NMR spectra of D-methyl xyloside's reaction mixture (24h)

   
      a-D-甲基木糖苷                b-D-甲基木糖苷
图3 D-甲基木糖苷
Fig.3 D- methyl xyloside

    反应中副产物较多(谱图出现四条甲氧基氢的谱峰)，推测可能是因为反应时间过长，HCl/CH₃OH溶液浓度过高，因此改进了反应条件：降低HCl/CH₃OH溶液的浓度至0.5%，缩短反应时间为5h，做反应混合物的¹H NMR谱图(图4，溶剂为DMSO)。从图4清楚地看出，d_H3.31ppm，d_H3.25ppm处出现了两条甲氧基氢的化学位移，比原来少了一倍，说明根据谱图分析结果改良的实验条件是正确的。但是仍然有两条甲氧基氢的谱峰，推测可能是温度还有点高，于是我们降低反应温度至0℃，但是反应混合物的¹H NMR谱图仍然显示两条甲氧基氢的谱峰(图5，溶剂为CDCl₃)，较图4并没有加以改进，说明降低温度并没有得到预期效果。

图4 反应5h D-甲基木糖苷反应混合物的¹H NMR谱
Fig.4 The ¹H NMR spectra of D-methyl xyloside's reaction mixture (5h)

图5 0℃ D-甲基木糖苷反应混合物的¹H NMR谱
Fig.5 The ¹H NMR spectra of D-methyl xyloside's reaction mixture (0℃)

    于是我们对图5又进行了详细分析，分析结果说明反应生成了a,b两种同分异构体(图3)，原因如下：
(1)如图5所示，除去-OCH₃中的氢(d_H3.48ppm，d_H3.42ppm)，产物其它氢(d_H3.87-d_H4.97ppm)的积分总面积为18.06，并且这些氢信号分成两组，一个甲基对应9个氢，两个甲基对应18个氢，符合两个糖环的结构。
(2)d_H4.97-4.96ppm，d_H4.85ppm处的谱峰必定来自H^(a)(图3)，因为H^(a)受两个氧原子的影响，其d_H应最大。b型产物中，H^(a)和H^(b)位于反式，它们之间的偶合常数应较大，a型产物中，H^(a)和H^(b)位于顺式，它们之间的偶合常数应较小^[8]，d_H4.97-4.96ppm，d_H4.85ppm处的谱峰正好一个裂分(J=4.5)，一个不裂分，符合a,b两种构型产物峰。
    同时其它位置谱峰的d_H及分裂情况也很符合a,b两种构型产物峰。
    为了证实以上分析结果，又做了D-甲基木糖苷反应混合物的GC-MS谱，谱图显示有两个产物峰，两个产物峰的分子离子峰均为164，且它们的碎片离子峰相同，再一次证明反应得到的是a,b两种构型产物。
    综上所述，通过分析D-甲基木糖苷混合物的¹H NMR谱，将反应条件由24h，1%HCl/CH₃OH，室温，优化到最终的5h，0.5%HCl/CH₃OH，室温。抑制了副产物的生成，使产率由最初的50%提高到了80%，得到了较纯的a,b-甲基木糖苷异构体混合物，在这种条件下，很难得到单一构型的D-甲基木糖苷。

4 结论
    本文通过分析反应混合物的¹H NMR 谱，不仅确定了目标产物的结构，而且优化了反应条件，抑制了副产物的生成。D-木糖是多羟基化合物，在合成D-甲基木糖苷时，其它羟基也很容易发生反应，而且得到的副产物性质相似，如果按照传统的合成研究方法，一开始就进行柱层析，很难将其分离。用反应混合物的¹H NMR 谱来研究实验条件，不仅可以确定产物结构，而且可以分析反应存在的问题，从而进一步改进实验，逐渐优化反应条件，减少副产物的生成，可以快速有效地得到目标产物，对合成研究具有很好的指导作用。

REFERENCES
[1] Ke Qiankun, Li Ke, Wu Fei, Liang Feng, Li Guoxiu. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2004, 35(5): 263-2645.
[2] Loomis C R, Bell R M. J. Biol. Chem., 1988, 263(4): 1682-1692.
[3] Chun M W, Shin D H, Song S Y, Lee Y H, Lee C H, Jeong L S, Lee S K. Nucleosides Nucleotides, 1999, 18: 617-618.
[4] Hu Jiehan, Hu Jiani. Explore Molecular Structure-Examples in deriving the Chemical Structure of Unknow Compounds. Beijing: Science Press, 2006: 111-127.
[5] Xue Song, Hu Jiehan, Zhang Wei, Yu Xingju, Yuan Quan. Chinese J. Anal. Chem., 2003, 31(12): 1493~1495.
[6] Xue Song, Hu Jiehan, Zhang Wei, Yuan Quan. Chinese J. Magn. Reson., 2003, 20(4): 379-385
[7] Chun M W, Lee S K. Korean Patent, 0086627, 2001.
[8] Hu Jiehan. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Beijing: Hydrocarbon Processing Press, 1988: 121.　

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