Study on the fluorophore doped polystyrene/silica nanoparticles

Li Yuejuan, Deng Yingchun, Meng Jianxin^#, Cao Liwei^#
(Department of Chemistry, ^#Institute of Nano-Chemistry, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Abstract In a effort to prepare efficient and uniform biolabels, we developed a novel fluorophore doped polystyrene-silica nanoparticles via sol-gel route. The copolymer precursors are obtained via copolymerizations of styrene (St) and 3-methactyloxylpropyltrimethoxylsilane (KH570). The controlled hydrolysis and condensation of tetraethyl orthosilicate (TEOS) in sol-gel route leads to the formation of fluorophore doped polystyrene-silica nanoparticles. The method could be applied to various fluorophore and significantly reduces dye leaching from the nanoparticles. The scanning electron microscope(SEM)showed that the nanoparticles are uniform, spherical and monodipersed with a diameter of  200 nm. The fluorescent nanoparticles prepared with the present method can give strong and stable fluorescence in water. They also have a silica surface and could be modified easily with many biomolecules for additional biochemical functionality. They are believed to be accepted as an effective biological labels.
Keywords KH570; sol-gel route；nanoparticles; Rhodmine B

染料掺杂聚苯乙烯/二氧化硅复合纳米颗粒的研究

李月娟，邓迎春，孟建新^#，曹丽伟^#
（暨南大学化学系，^#暨南大学纳米化学研究所，广州，510632）

2008年1月20日收到;国家自然科学基金(20475021)和广东省自然科学基金团队项目(05200555)资助

摘要 先利用苯乙烯与3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH570)化学反应合成共聚前驱物, 再采用凝胶-溶胶法，利用TEOS在一定的条件下水解与缩合，合成了聚苯乙烯-二氧化硅复合纳米颗粒。将多种荧光染料掺杂其中成功制备出荧光复合纳米颗粒，既克服了传统物理包裹方法染料容易泄漏的问题，又不受到化学键合方法对染料分子性质的限制。用扫描电子显微镜表征该复合纳米颗粒呈球形，大小均匀，直径为200nm左右。所制得的纳米颗粒荧光性质稳定，受外界环境的影响小，且潜在生物亲和性，是一种新型的荧光标记物。
关键词 KH570；凝胶-溶胶法；复合纳米颗粒； 罗丹明B

    随着纳米技术和生物技术的结合，发展起来的核壳型荧光纳米标记物的制备为生物医学领域的研究提供了新的材料、技术和方法^[1-8]，与传统的有机染料标记相比，核壳型荧光纳米标记物光稳定性好，发光强度高，制备过程简单，条件温和，试剂便宜^{[ 9-10]}。它们的均一粒径和生物相容性使修饰变得容易 。这些优点使得核-壳型荧光纳米标记物应用于多种科学研究和临床诊断^[11-14]。Xu Hun^[15]等在室温下采用正硅酸乙酯水解产物包裹油包水微胶囊，制备了以联吡啶钌配合物为核、二氧化硅为壳的荧光纳米颗粒，并用于免疫分析。这种直接将荧光染料物理包裹于二氧化硅的方法存在着明显的荧光染料泄漏问题。原茵^[16]等通过氨基硅烷化试剂与有机荧光染料异硫氰酸罗丹明B 化学键合，与正硅酸乙酯在油包水形成的微胶囊中同步水解，成功制备了嵌合异硫氰酸罗丹明B 的核壳荧光纳米颗粒。这种化学键合制备核壳荧光纳米颗粒的方法能有效地防止荧光染料泄漏，但是对染料分子的性质有要求，在实际应用中受到限制。本文发展了一种使荧光染料有更高包埋效率物理包裹新方法。在本方法中，首先用硅烷偶联剂3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)修饰聚苯乙烯纳米颗粒，使其羟基化。再用凝胶－溶胶法制备了掺杂多种荧光染料的PS-SiO₂复合纳米颗粒，并研究了多种染料掺杂在此体系中泄漏规律。实验发现，多种染料用此一种方法很容易掺杂进去。该方法既克服了传统物理包裹方法染料容易泄漏的问题，又不受到化学键合方法对染料分子性质的限制。可望在基于荧光纳米颗粒的标记研究中得到应用。

1 实验部分
1.1 主要试剂及仪器
    苯乙烯(PS)(天津市福晨化学试剂厂)(使用前用10 %的氢氧化钠水溶液萃取3次, 再用水反复萃取, 无水硫酸钠干燥48h 后,在35℃减压蒸馏， 最后得到的单体在气相色谱上未出现杂质峰， 将纯化的苯乙烯在-10 ℃下保存待用), 四乙氧基硅烷(TEOS，Aldrich公司)，四苯基卟啉(TPP)(香港浸会大学提供)，其他试剂荧光素(Fluorescein)、钙黄绿素(Calcein)、罗丹明B(Rhodmine B)、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)、甲醇、Triton X-100、甲苯、过硫酸钾(PPS)、无水乙醇、碳酸氢钠、十二烷基苯磺酸钠(SDS)、 25%-28%氨水、二甲基亚砜均为分析纯试剂, 所用水均为二次蒸馏水。实验所用仪器为：970MC型荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司), LEO 1530型扫描电子显微镜, 旋转蒸发仪RE52AA (上海亚荣仪器厂), DF-Ⅱ磁力加热搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂), GC－14C气相色谱(日本岛津)。
1.2 实验方法
1.2.1 羟基化聚苯乙烯纳米颗粒的制备
   将0.8g十二烷基苯磺酸钠(SDS)，0.3g过硫酸钾(PPS)和0.084g碳酸氢钠(NaHCO₃)共同溶于100mL一次水中，于油浴70℃，通N₂的气氛下搅拌数分钟，加入2mL苯乙烯单体,反应24h后加入2mL硅烷偶连剂KH-570，继续反应12h，反应过程如图1所示。用10倍甲醇将羟基化聚苯乙烯水胶乳稀释，SDS、苯乙烯单体和低聚物可溶于甲醇，羟基化聚苯乙烯颗粒凝集析出。离心分离，用甲醇和蒸馏水反复洗涤，烘干待用。

图1 制备羟基化共聚前驱物
Fig.1 Synthesis of hydroxy-containing polymer precursors

1.2.2 掺杂多种染料的聚苯乙烯/二氧化硅(PS/SiO₂)的制备
    采用凝胶-溶胶法^{[ 17-18]}，称取0.2g羟基化聚苯乙烯纳米颗粒,将其溶解于2mL的甲苯中，待其溶解后，加入2mL TEOS，370mL Triton-100, 一定量的染料，反应0.5h。于另一100 mL的锥形瓶中，加入50mL的无水乙醇，10mL 25％氨水，搅拌数分钟后，两锥形瓶液体混合，继续搅拌24h。离心分离，烘干待用。
1.2.3 掺杂多种染料泄漏实验
    各取适量所制备的荧光复合纳米颗粒，将其分散于4mL蒸馏水中，超声振荡10min后，得一悬浮液，在各自的激发波长下检测该悬物液的荧光强度，然后再将悬物液离心分离，沉降下来的纳米颗粒又重新分散在4mL水中，重复上述操作数次，通过荧光强度的变化情况确定有机荧光染料的泄漏程度。
1.2.4 罗丹明B掺杂量对发光强度的影响
    分别称取20mg掺杂量为25mg, 30mg, 35mg, 50mg罗丹明B所制备的荧光复合纳米颗粒，水洗2次后，将其分散于4mL蒸馏水中，超声振荡10min后，得一悬浮液，用970MC型荧光分光光度计在559 nm的激发波长下检测该悬物液的荧光强度，以确定染料的最佳加入量。
1.2.5 掺杂罗丹明B纳米粒子的光稳定性实验
    取一定量的掺杂罗丹明B的纳米颗粒分散在4mL 水中，超声振荡10min后，放在氘灯下照射，每照射10min, 测一次荧光强度，通过荧光强度的变化来确定荧光纳米颗粒的光稳定性。

2 结果与讨论
2.1 PS/SiO₂复合纳米颗粒的制备
    利用凝胶-溶胶法制备纳米颗粒的装置简单，操作容易，无需高温、高压及其他苛刻的实验条件，在室温下可制备出包覆二氧化硅外壳的荧光纳米颗粒。图2和图3分别是所制备的未掺染料和掺杂了罗丹明B的PS/SiO₂复合纳米颗粒的扫描电子显微镜照片(SEM)(F=200±5 nm)。纳米颗粒呈球形且大小均一，分散性好。掺杂了染料的纳米颗粒与没掺染料的相比，粒径无明显增大。

图2 未掺染料PS/SiO₂纳米颗粒扫描电子显微镜照片
Fig.2 SEM image of PS/SiO₂ nanoparticles

图3 掺罗丹明B PS/SiO₂纳米颗粒扫描电子显微镜照片
Fig.3 SEM image of PS/SiO₂ nanoparticles doped with Rhodmine B

2.2 掺杂多种染料泄漏规律
    实验对比了不同荧光染料掺杂在PS/SiO₂复合纳米颗粒里水洗泄漏情况。如图4所示，掺杂荧光素(Fluorescein)的纳米颗粒水洗8次后，荧光强度下降到初始强度的13.86%，钙黄绿素(Calcein)为初始的51.10%，四苯基卟啉(TPP)为初始的92.64%，罗丹明B(Rhodmine B)为初始的106.54%。从图中还可以看出, 掺杂罗丹明B的纳米颗粒水洗2次的荧光强度有所上升,之后基本趋于平稳。掺杂四苯基卟啉、钙黄绿素和荧光素的纳米颗粒水洗2次的荧光强度下降，之后趋于不同程度的平稳。这些不同的染料掺杂进入到PS/SiO₂复合纳米颗粒中时，一部分掺杂在二氧化硅外层，一部分通过二氧化硅层掺杂到聚苯乙烯内层。由于二氧化硅的亲水性和网状结构，水分子很容易进入，所以掺杂在二氧化硅外层的染料水洗时很容易泄漏；由于聚苯乙烯的疏水性，水分子很难通过聚苯乙烯接触到染料，所以掺杂到聚苯乙烯内层的染料水洗时基本不泄漏。这就是这些染料水洗2次后趋于平稳的原因。掺杂罗丹明B的纳米颗粒水洗2次的荧光强度有所上升，可能的原因是水洗1次时主要是掺杂在二氧化硅中的罗丹明B被激发发光，水洗2次后二氧化硅层中的罗丹明B被洗掉，被激发发光的是聚苯乙烯内层的罗丹明B，由于聚苯乙烯的极性小，所以聚苯乙烯内层的罗丹明B被激发发光强一些。实验发现，多种染料用此一种方法很容易掺杂进去。该方法既克服了传统物理包裹方法染料容易泄漏的问题，又不受到化学键合方法对染料分子性质的限制。不同染料在PS/SiO₂复合纳米颗粒里的包埋效率有差异，罗丹明B包埋效率最高，其次是四苯基卟啉，最低的是荧光素，这可能跟染料的分子结构有关。钙黄绿素、荧光素分子中都含有羧基，在弱碱性环境中呈离子态，更容易进入到二氧化硅外层所以水洗时较容易泄漏。而罗丹明B、四苯基卟啉分子在弱碱性环境带电性较差,易于进入到聚苯乙烯内层，所以水洗时不容易泄漏。这一规律的得出，对我们以后选择适合PS/SiO₂复合纳米 颗粒的染料提供了依据。

图4 PS/SiO₂纳米颗粒掺杂多种染料水洗泄漏情况
Fig.4 Dye leaking of PS/SiO₂ nanoparticles doped with different dyes

2.3 罗丹明B掺杂量对发光强度的影响
    图5对比了罗丹明B水溶液和掺杂罗丹明B的荧光纳米颗粒的发射光谱，从图中可以看出，两光谱形状基本一致，只是最大发射波长的位置有所移动，与罗丹明B水溶液的最大发射波长587nm相比，纳米颗粒的最大发射波长蓝移了2nm, 为585nm。这说明罗丹明B掺入到纳米颗粒中后，并未改变其性质，本文发展的是一种物理包裹染料不泄漏的方法。为考察罗丹明B掺杂量对所形成的荧光纳米颗粒荧光强度的影响，通过改变加入罗丹明B的量来改变荧光染料在纳米颗粒中的浓度。实验结果如图6所示，随着染料掺杂量的增加，荧光强度增大，罗丹明B掺杂量为35mg时达到最大。继续增加罗丹明B的量，其荧光强度逐渐减低，这表明当这一体系中荧光染料的浓度达到一定值后存在荧光自猝灭效应。

图5 罗丹明B水溶液与PS/SiO₂纳米颗粒发射光谱
Fig.5 Emission spectra of Rhodmine B water solution and PS/SiO₂ nanoparticles

图6 PS/SiO₂纳米颗粒的荧光强度随罗丹明B掺杂量的变化
Fig.6 Rhodmine B quality effect on fluorescence intensities of PS/SiO₂ nanoparticles

2.4 掺杂罗丹明B纳米颗粒的稳定性
    考察了罗丹明B掺杂到纳米颗粒后的光稳定性，在氘灯下照射110min后，纳米颗粒的荧光强度下降到初始强度的77%左右。还考察了该纳米颗粒的固体稳定性和分散在有机溶剂二甲基亚砜中的稳定性，将固体纳米颗粒和分散在二甲基亚砜中的纳米颗粒分别放置，每天测一次荧光强度，通过15天的连续测量发现，两者的荧光强度下降趋势都很小。这些实验都表明罗丹明B掺杂到纳米颗粒中后，能屏蔽外界对壳内荧光物质的影响，使罗丹明B的稳定性得到提高。

3 结 论
    本文采用凝胶－溶胶法成功地制备出了掺杂多种染料的荧光复合纳米颗粒。该方法操作简单，条件温和，所制备的复合纳米颗粒大小均一，分散性好，稳定性好。而且该物理包裹方法很好地解决了染料泄漏的问题，又对染料分子的性质没有严格要求。该荧光纳米颗粒的表面可以方便地利用APTEOS等进行修饰以形成活性基团，与生物抗体等免疫物质偶联，可作为新型的标记物应用于生物学研究和医学诊断等领域。有关的研究正在进一步进行中。

REFERENCES
[1] Bruchez M J, Moronn M, et al. Science, 1998, 281: 2013.
[2] Chan W C, Nie S M, Science, 1998, 281: 2016.
[3] He X X, Wang K M, Tan W H, et al . Chinese Science Bulletin (Kexue Tongbao), 2001, 46 (16): 1353.
[4] He X X , Wang K M , Tan W H, et al. J. Nanosci. Nanotech., 2002, 2 (3) : 317.
[5] Santra S, Zhang P, Wang K M, et al. Anal. Chem., 2001, 73: 4988.
[6] Santra S, Wang K M, et al. J. Biomed. Opt., 2001, 6: 160.
[7] Ning Q Y, Meng J X, Wang H M. Chemical Journal on Internet, 2005, 7(10): 69-74.
[8] Karst U. Anal. Bioanal. Chem., 2006, 384: 559.
[9] Yang W, Zhang C G, et al. Anal.Chim.Acta. , 2004, 503: 163.
[10] Harma H, Pelkkikangas A, Soukka T, et al. Anal.Chim. Acta., 2003, 482: 157.
[11] Bagwe, Yang R P, et al. Langmuir, 2004, 20: 8336.
[12] Lian W, Litherland S A, et al. Anal. Biochem. , 2004, 334: 135.
[13] Tan M Q, Wang G L et al. J. Luminesc. , 2006, 117: 20.
[14] Ye Z Q, Tan M Q et al. Talanta, 2005, 65: 206.
[15] Xu H, Zhu J Z. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22: 2743.
[16] Yuan Y, He X X, Wang K M, et al. Chem. J. Chin. Univ. (Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebao), 2005, 26 (3): 446.
[17] Ding X F, Jiang Y Q, et al. Materials Letters, 2004, 58: 1722.
[18] Hanan S, David A. Chem. Mater., 2003, 15: 1690.

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