Determination of Sugars in Tobacco by High-Performance Liquid Chromatography and Sample Preparation with High-speed Homogenization

匀浆法提取-高效液相色谱法测定烟草中的糖

贺 宾¹，徐祎然^1,2，李银科^1,2，杨光宇¹，胡秋芬 ^1,2*
(1. 云南省烟草化学重点试验室，云南烟草科学研究院，昆明 650106；2. 云南民族大学化学与生物技术学院；昆明 650031)

*云南省省院省校科技合作项目(2006YX17)；和中烟云南工业公司重大专项(2006B309)资助

摘要 研究了用匀浆法提取，高效液相色谱法测定烟草中的糖。烟草样品用80%的甲醇为提取液匀浆法提取。提取液中的糖以Waters carbohydrate 高效糖柱为固定相，80％的乙腈作为流动相分离，蒸发光散射检测器检测测定，一次进样可测定鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖8种糖。该方法标准回收率在91 - 104%之间，相对标准偏差均小于3.4%。结果满意。
关键词 高效液相色谱法；匀浆法提取；烟草；糖

1 引言
    糖是烟草中的重要成分，烟草中糖的含量和烟草品质有密切的相关性，烟草中糖的测定已逐渐成为国内外烟草行业的质量控制内容 ^[1-2]；目前，糖的测定方法主要有费林试剂法、近红外分光光度法、连续流动分析法、毛细管电泳法、气相色谱法和高效液相色谱法等；样品前处理一般采用回流提取，振荡浸取、超声浸取等方法^[2-7]。匀浆提取是指组织通过加入萃取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取组织中有效成分的一种提取方法，该方法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，目前已在样品前处理中得到广泛应用 ^[8-10]；但是匀浆法在烟草分析中的应用还未见报道过。我们研究了用80％的乙腈匀浆法提取，高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测测定烟草中糖的方法，实现了烟草中8种水溶性单糖和二糖的同时测定，取得满意结果。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
    Waters 2690 Alliance高效液相色谱系统，包括四元梯度泵，Empower色谱工作站，ELSD 2000 蒸发光散射检测器 (美国Waters公司)；Milli-Q50高纯水处理器(美国Millipore公司)；D-果糖、D-葡萄糖、L-甘露糖 (Sigma公司)；麦芽糖、蔗糖、D-木糖 (Supelco公司)；L-鼠李糖、DL-阿拉伯糖 (Fluka公司)；各种糖标样的纯度均大于99%。甲醇和乙腈为色谱纯试剂（Fisher公司）。实验用水为高纯水。
    配制质量浓度均为5.0 g/L的鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等8种糖的标准储备水溶液，使用前用水稀释成所需浓度的标准工作溶液。
2.2 色谱条件
    分析柱为Waters carbohydrate高效糖柱(250 mm × 4.6 mm i.d., 4μm)，美国Waters公司产品。流动相为80％乙腈，流速为2.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量20 μL；ELSD的漂移管温度85℃，氮气作载气，流速2.00 L/min。在该条件下糖标样及烟草样品的色谱图见图1所示。
2.3 样品处理
    按YC/T31-1996规定的方法制备烟草样品。准确称取0.500 g烟样，置于50 mL锥型瓶中，准确加入80%的甲醇25 mL，置于高速匀浆机中20000转/min 匀浆提取2.0 min。提取液用0.45 m m的针头过滤器过滤，供液相色谱分析用。

3 结果与讨论
3.1 样品处理条件
    对于烟草样品中糖，一般采用水或80％的甲醇水溶液提取 ^[2]，用80％的甲醇提取可避免二糖、多糖水解，测定结果更可靠；因此本实验选择用80％的甲醇为提取溶剂。分别用匀浆法、振荡浸取法和超声波浸取法对相同的样品进行提取比较，结果表明：每 0.5 g的样品用80％的甲醇25 mL提取，振荡浸取120 min、超生浸取 40 min、高速匀浆机20000 转/min 提取 2.0 min 均可使样品中的糖完全溶出；高速匀浆法效率明显高于振荡浸取和超生浸取法；因此本实验选用高速匀浆法20000 转/min 提取 2.0 min。
3.2 流动相的选择      
    Waters公司高效糖柱一般用水-乙腈作为流动相，乙腈在流动相中比例增大，可有效改善色谱峰形，有利于各组分的基线分离，但有机相比例增加不利于糖的溶解，分析时间也显著延长。当增加流动相中水的比例时，分析时间变短。但水的比例过大，组分峰相互靠近，阿拉伯糖与果糖、甘露糖与葡萄糖不能实现基线分离；同时，也不利于流动相在漂移管内的汽化，使基线噪声增大，从而导致分析灵敏度的降低。综合考虑分离效果、分析时间等因素，本文选择80％的乙腈作为流动相。
3.3 ELSD参数的选择         
    漂移管温度和载气流速是ELSD检测器的两个重要参数。漂移管温度影响检测器的响应，温度升高，流动相蒸发趋于完全，信噪比上升，但温度过高，可能导致组分部分汽化，信号响应值变小。雾化载气流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响检测器的响应。信噪比随流速的增加而升高。本文选择漂移管温度为85℃，氮气作载气，流速2.00 L/min，可达到最小的噪声信号，色谱图基线平稳。
3.4 工作曲线与检出限　
    配制系列不同浓度的标准溶液，在选定色谱条件下进样20 m L，根据测得的峰面积A（单位：mV. S）对糖的浓度 (mg/mL)进行线性回归，得到回归方程。再将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样20 m L，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限，结果见表1。

表1 各种糖的标准曲线方程、相关系数、线形范围和检出限

3.5 日内精密度实验
    烟草在相同条件下平行测定7次 (同批次处理)，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差，可得鼠李糖的RSD为2.8%、木糖的RSD为3.1%、阿拉伯糖的RSD为2.5%、果糖的RSD为1.6%、甘露糖的RSD为2.6%、葡萄糖的RSD为2.5%、蔗糖的RSD为2.0%、麦芽糖的RSD为2.8%，说明方法精密度良好。
3.6 日间精密度实验
    卷烟样品在不同时间内测定(每天测定1次，共7次)，计算7次测定结果的相对标准偏差，可得鼠李糖的RSD为3.1%、木糖的RSD为3.0%、阿拉伯糖的RSD为2.8%、果糖的RSD为2.2%、甘露糖的RSD为3.3%、葡萄糖的RSD为2.8%、蔗糖的RSD为2.1%、麦芽糖的RSD为3.4%、；说明在不同时间内测定，方法精密度仍然良好。
3.7 回收率实验
    样品按选定的样品前处理条件处理，并按选定色谱条件进样分析，测定时捕集相同的烟气样品2份，其中一份为基准，另一份加入已知量的糖标氧(设 0.05 mg、0.2 mg、1.0 mg三个添加量)，通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率。得各糖的回收率在91-104%之间，说明方法回收率很高。

4 结论
    本方法采用匀浆法提取，Waters carbohydrate 高效糖柱为固定相，80％乙腈为流动相，蒸发光散射检测器检测测定烟草样品中的糖，一次进样可同时测定烟草样品中的8种糖，是一次进样能测定中糖个数较多的方法之一；且本方法样品处理采用高速匀浆法，高速匀浆法提取具有提取完全、效率高、能耗低等特点，所需时间明显少于振荡浸取法和超声波浸取法。总之，该方法准确可靠，重现性好，回收率满意，检出限较低，可用于烟草中糖含量的质量分析与控制，具有实用价值。