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Jan. 1, 2003 Vol.5 No.1 P.10 Copyright |
Wang Yuebo, Wu Xia * , Yang
Jinghe, Ren Xuezhen, Luan Yuxia, Sun Shuna
(Key Lab for Colloid and Interface Chemistry of Education Ministry, School of Chemistry
and Chemical Engineering, Shandong University, Jinan , 250100, Shandong, China)
Abstract In the presence of CPB and CP as
probe, a new determination method of nucleic acids was developed. In the HMTA-HCl buffer
(PH 4.5), the weak light scattering of m-cresol purple and CPB were enhanced greatly by
addition of nucleic acids and the enhanced intensity of RLS was in proportion to the
concentration of nucleic acids. The linear range is 1.0×10-7-2.0×10-5g/mL
for fsDNA, and 1.0×10-7-5.0×10-5 g/mL for ctDNA. The effective
factors and the optimum conditions have been studied and the detection limits of fsDNA and
ctDNA are 10ng/mL and 26ng/mL.
Keywords resonance light scattering(RLS), CPB, m-cresol purple(CP), nucleic acid
核酸-间甲酚紫体系共振光散射的研究
王粤博 吴霞* 杨景和 任学贞 栾玉霞 孙姝娜(山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室, 化学与化工学院, 济南, 250100)
2002年10月2日收稿。
摘要 建立了溴代十六烷基吡啶（CPB）存在下，用间甲酚紫(CP)为探针测定核酸的新方法。在HMTA-HCl缓冲溶液（pH=4.5）中，核酸的加入使CP-CPB体系的共振光散射（RLS）增强，此RLS信号与DNA浓度成正比，fsDNA和 ctDNA的线性范围分别为1.0×10-7～2.0×10-5g/mL和1.0×10-7～5.0×10-5 g/mL，检出限分别为10ng/mL和26 ng/mL。关键词 共振光散射；间甲酚紫；核酸；溴代十六烷基吡啶
核酸作为重要的遗传物质，其研究是化学、生物等诸多学科中最为活跃的领域之一，而核酸的定量测定是研究核酸的基础。近年来，共振光散射（Resonance
Light Scattering, RLS）技术已成为一项用来测定和研究生物大分子的新技术，它通过使用常规的荧光分光光度计测量共振光散射强度。自Huang等[1,2]将此技术应用于核酸的定量测定以来，共振光散射法成为继分光光度法[3]、荧光法[4]之后，又一新的高灵敏度的核酸测定方法。目前，利用增强有机染料共振光散射测定核酸的报道有藏红T[5]、罗丹明B[6]、耐尔蓝硫酸盐[7]、亚甲基蓝
[8]和亮绿[9]等。本文基于DNA可使CP-CPB体系的共振光散射增强的现象，研究了间甲酚紫与核酸作用的共振光散射光谱，据此建立了一种新的测定核酸的方法。
1.1 化学试剂与仪器
鲱鱼精子DNA（fsDNA）（1.00×10-4 g/mL）, 小牛胸腺DNA（ctDNA）（1.00×10-4 g/mL）， 间甲酚紫（CP, 1.0×10-2 mol/L）, HMTA-HCl 缓冲溶液(pH值为4.5), 十六烷基三甲基吡啶（CPB, 1.0×10-2 mol/L）. 以上试剂皆为分析纯，实验用水为三次蒸馏水。日立850型荧光分光光度计（Hitachi），岛津RF-540型荧光分光光度计（Shimadzu），pHS-2型酸度计（上海雷磁仪器厂）。
1.2 实验方法
在25 mL 比色管中依次加入0.50 mL 1.0×10-2mol/L的间甲酚紫溶液，一定量的DNA溶液，2.0 mL HMTA-HCl缓冲溶液和1.0 mL 1.0×10-2mol/L 的CPB溶液，用蒸馏水定容至10 mL，振荡均匀，放置20 min。然后，用1cm比色池，以lex=lem方式进行同步扫描，测得共振光散射光谱，于最大共振散射峰(lmaxRLS=550 nm)处，测定核酸加入前后溶液的共振光散射强度差DIRLS（DIRLS =IRLS- IRISo。IRISo，IRLS分别为核酸加入前后体系的共振光散射强度）。
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图1 体系的共振光散射光谱 Fig.1 RLS spectrum of CP-CPB(1), CP-CPB-fsDNA(2) and CP-CPB-ctDNA(3) Conditions: pH=4.5 , CP:5.0×10-4mol/L , CPB: 1.0×10-3mol/L , fsDNA: 5.0×10-6g/mL , ctDNA: 5.0×10-6g/mL |
2. 结果与讨论
2.1 共振光散射光谱
如图1所示，CP-CPB在550nm, 620nm处有弱的散射。DNA的加入使550nm处的共振光散射强度大大增加.
故实验中选择550nm为测量波长.
2.2 最佳反应条件的选择
当CP浓度为5.0×10-4mol/L，HMTA-HCl缓冲液pH为4.5，CPB浓度为1.0×10-3mol/L，体系的共振光散射强度增强最大。试剂加入顺序以染料CP-DNA-缓冲溶液-CPB的顺序为最好。体系的
2.3 共存物质的影响
在最佳实验条件下，固定fsDNA的浓度为5.0×10-6g/mL，对多种氨基酸，蛋白质和阳离子等进行了干扰实验。发现Al3+, Mg2+, HSA, BSA有较大干扰。 3. 分析应用
在最佳实验条件下，fsDNA和ctDNA的线性范围分别为1.0×10-7～2.0×10-5g/mL和1.0×10-7～5.0×10-5g/mL，检出限分别为10ng/mL和26 ng/mL，相关系数分别为0.9972和0.9923。用标准加入法测定合成样品（样品中NaCl1.0×10-5mol/L, MnSO41.0×10-6mol/L, fsDNA1.0×10-6 g/mL）,回收率为94.6%～106%。
REFERENCES
[1] Huang C Z, Li K A, Tong S Y. Anal. Chem. (Fenxi Huaxue), 1996, 68 (13): 2259.
[2] Huang C Z, Li K A, Tong S Y. Anal. Chem. (Fenxi Huaxue), 1997, 69 (3): 514.
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