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Jun. 1, 2003 Vol.5 No.6 P.44 Copyright |
Shen Jingru, Sun Xiaomei, Lei Zhuolin, Zhu
Yong, Ding Zhigang
(College of Chemistry and Life Science, South-Central University for Ethnic Communities,
Wuhan 430074)
Abstract Catalytic determination of
glucose with mimic glucose oxidase was constructed by the reaction of b-cyclodextrin,
maleic anhydride, chloroactic acid with iron trichloride in hydrogen peroxide. The method
is simple and convenient, and sensitivity and reappearance are ideal. The linear range is
30-197mg·mL-1,
while the detection limit is 4 mg·mL-1, the RSD is 0.98% (n=8). The recovery of
sample is 95.8%-103.1%.
Keywords Glucose, b-Cyclodextrin
derivant, Mimic glucose oxidase, Catalysize to analyse
沈静茹 孙小梅 雷灼霖 朱 用 丁志刚
（中南民族大学化学与生命科学学院，武汉，430074）
2003年4月30日收稿；湖北省自然科学基金资助项目(95160)
摘要 报道了用双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸酯)]-
b-环糊精同三氯化铁构筑模拟葡萄糖氧化酶 (GOD)，对葡萄糖进行催化氧化，据此，建立了模拟酶催化法测定葡萄糖的新方法。该法的线性范围为30-197mg·mL-1, 检测下限为4 mg·mL-1, 精密度试验RSD为 0.98% (n＝8)。方法用于葡萄糖针剂中葡萄糖含量的测定，回收率为95.8%-103.1%。关键词 葡萄糖, b-环糊精衍生物, 模拟葡萄糖氧化酶, 催化分析
葡萄糖是临床化学中检测的重要指标，目前普遍采用的方法主要有化学发光法[1]、分光光度法[2]、电化学法[3]等。虽然检测手段不同，但几乎都是采用一个相同的反应机理，即葡萄糖在氧化酶的作用下与氧反应转变为葡萄糖酸和H2O2，通过测定O2浓度的降低或H2O2浓度的升高而间接测定[4]。酶试剂较贵，对酸、碱、热不稳定, 反应条件苛刻, 容易失活变性,因此，模拟天然酶的研究是一个很有意义的课题。现在有用金属卟啉化合物[5]或氯化血红素[6]模拟辣根过氧化物酶与葡萄糖氧化反应偶联测定葡萄糖的，尚需与葡萄糖氧化酶偶联才能测定。
我们利用双[-6氧-(3-脱氧柠檬酸酯)]-b-环糊精 (CD) 与三氯化铁形成的配合物模拟GOD，采用邻甲苯胺法[7]测定葡萄糖。该法测定葡萄糖无需特殊条件，灵敏度、重现性较好，线性范围较宽，回收率结果理想，且模拟酶制备简便，费用低廉，易储存，不易失活变性，是一种较理想的新型葡萄糖测定方法。模拟酶制备反应式如下：
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
UV-240 紫外-可见分光光度计，日本岛津；752型紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂；pHS-3C数字酸度计，杭州万达仪器仪表厂；TG-332A微量分析天平，上海分析仪器厂。
葡萄糖标准溶液；0.100 mol·L-1和2.000×10-3
mol·L-1；配合物
1.2 模拟酶b-CD-(M)2·Fe3+·H2O2的制备
取0.1000g配合物b-CD-(M)2·Fe3+溶于9.20 mL二次水中，不断搅拌下加入0.80 mL 30％ H2O2，复合30min后制得模拟酶溶液，浓度为6.556 × 10-3 mol·L-1备用。
1.3 模拟酶的催化反应
取6.556×10-3 mol·L-1 模拟酶溶液4.00 mL于一小烧杯中，加2.00 mL水，在不断搅拌下加入0.100 mol·L-1的葡萄糖溶液7.00 mL，将反应温度控制在80℃，并开始计时取样，每隔10 min 用微量取样器抽提50mL反应液，加50mL (0.400 mol·L-1) 邻甲苯胺溶液，混匀，放入80℃的水浴中保温一定时间后，用二次水定容至5.00 mL，以不加底物葡萄糖的溶液为参比，在波长365nm处测定A值。对照实验Ⅰ：用相同量的配合物代替模拟酶；对照实验Ⅱ：用相同量的H2O2 代替模拟酶；对照实验Ⅲ：用相同量的FeCl3与H2O2复合物代替模拟酶。结果见图1。
1.4 测定葡萄糖方法
分别取一定体积2.000× 10-3 mol·L-1葡萄糖标准溶液和一定体积的6.556× 10-3 mol·L-1模拟酶溶液，加入一定体积二次水于恒温 (80℃) 水浴中保温一定时间后，取出冷却至室温，加入一定体积的4.00× 10-4 mol·L-1邻甲苯胺的DMF溶液，放置一定时间后，用水定容至5.00 mL，以不加底物葡萄糖的溶液作对应空白，在365nm 波长处测定吸光度A。 2 结果与讨论
2.1 模拟酶催化法的确定
图１结果表明，随着模拟酶催化葡萄糖反应的进行，吸光度A365值逐渐增加，40min催化反应基本进行完全后出现平台，且模拟酶的催化速率比配合物b-CD-(M)2·Fe3+、FeCl3+H2O2、H2O2快得多。由此建立了用模拟酶催化法测定葡萄糖的新方法。
图1 模拟酶催化葡萄糖的动力学曲线
Fig. 1 Catalytic kinetics of mimic glucose oxidase.
System: C模拟酶 = 2.000 × 10-3 mol·L-1; C邻甲苯胺 = 0.200 mol·L-1; t = 80℃
b-CD-(M)2·Fe3+·H2O2 (□); b-CD-(M)2·Fe3+ (△); H2O2 (×); FeCl3+H2O2 (○)
2.2 模拟酶浓度的影响
在具塞刻度试管中加入2.000× 10-3 mol·L-1葡萄糖标准溶液3.00
mL和2.00 mL二次水，6.556×10-3 mol·L-1模拟酶分别取50，100，120，150，200，250，300
2.3 邻甲苯胺显色剂用量的影响
在具塞刻度试管中加入2.000×10-3 mol·L-1葡萄糖标准溶液3.00 mL和2.00 mL二次水，6.556×10-3 mol·L-1模拟酶取100 mL，置于80℃水浴中，50min后取出，冷却后分别取4.00×10-4 mol·L-1邻甲苯胺的DMF溶液120，160，200，240，280，320，360，400 mL，混匀，放置60 min后，以不加底物葡萄糖的溶液作对应空白，测A365值。结果表明，显色剂用量加大，吸光度也增大，当浓度为2.36 × 10-5 mol·L-1时灵敏度达到最大，随后吸光度基本不变，说明显色剂用量已饱和。
2.4 酸度的影响
在具塞刻度试管中加入2.000× 10-3 mol·L-1葡萄糖标准溶液1.50 mL (3.0×10-6mol)，6.556× 10-3 mol·L-1模拟酶100 mL (根据模拟酶与葡萄糖最佳摩尔比的量)，分别取pH值为3.6，3.8，4.5，5.4，6.2，7.7，8.2，8.8，9.4，10.0缓冲液3.50 mL，置于80℃水浴中，50min后取出，冷却至室温，加入4.00× 10-4 mol·L-1邻甲苯胺的DMF溶液320 mL，混匀，放置60 min后，以不加底物葡萄糖的溶液作对应空白，测A365值。结果见图2，从图中可看出，在最佳反应酸度pH 8.8时A365值最高，大于或小于此值对测定的灵敏度均有不同程度的影响。在pH3.8-4.5之间灵敏度出现另一小峰，这有可能是酸度对模拟酶结构的稳定性[如Fe3+与b-CD-(M)2的配合]和邻甲苯胺的综合影响所致。
图2 酸度对分析灵敏度的影响
Fig. 2 Effect of pH on analytic sensitivity.
System: C模拟酶 = 1.31×10-4 mol·L-1; C邻甲苯胺 = 2.36×10-5 mol·L-1; t = 80℃
2.5 工作曲线和干扰离子的影响
在选定的最佳条件 (C模拟酶 = 1.31×10-4 mol·L-1,
C邻甲苯胺 = 2.36×10-5 mol·L-1, pH=8.8, t = 80℃)
下进行测定，葡萄糖的浓度在30-197 mg·mL-1之间，线性理想，其线性回归方程为：A＝2.4×10-3C–0.0052，线性相关系数
在葡萄糖制剂中，共存的主要是些无机离子，由实验可知，相对葡萄糖量70倍Zn2+、80倍Ba2+、100倍Cl-、K+、Ca2+、Mg2+对测定无干扰，60倍的Al3+对测定干扰严重。
2.6 精密度实验
取一定量被测液，在365nm处测定吸收值，并按回归方程计算。共重复测定8次，结果平均测得量为：（140.6±1.4）mg·mL-1, 相对标准偏差(RSD)0.98%。根据3倍标准偏差计算，最低检测限为4 mg·mL-1。
2.7 样品测定及回收实验
根据工作曲线选定的最佳检测条件，测定5%葡萄糖针剂中葡萄糖含量，按回归方程计算。结果见下表：
表1 试样中葡萄糖的分析结果和回收率
试 样 |
试样含量 |
标样加入量 |
测得总量 |
回收率 |
1 |
59.7 |
22.7 |
83.1 |
103.1 |
2 |
59.7 |
37.8 |
96.7 |
97.9 |
3 |
59.7 |
136.2 |
190.2 |
95.8 |
[1] Zhou Y X, Nagaoka T, Li F et al. Talanta, 1999, 48 (2): 461.
[2] Shi Y, Crouch S R. Anal. Chim. Acta, 1999, 381 (2): 165.
[3] Wang J, Fang L, Lopez D et al. Anal. Lett., 1993, 26 (9): 1819.
[4] Wei SL, Deng G H. Chinese Journal of Analytical Chemistry (Fenxi Huaxue), 2001, 29 (4): 425.
[5] Yao Fengji, Wang L T. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, 1999, 35 (4): 437.
[6] Gao J Z, Yang B. Analytical Laboratory (Fenxi Shiyan Shi), 1998, 17 (6): 35.
[7] Analytical Chemistry Section of Hangzhou University. The Handbook of Analytical Chemistry, 3rd Section, Beijing: Chemical Industry Press, 1983: 562.
[8] Ren W H, Ding Z G, Song F J et al. Chinese Journal of Organic Chemistry (Youji Huaxue), 1998, 18: 66.