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Aug. 1, 2003 Vol.5 No.8 P.63 Copyright |
Ye huazhen1, Wang Jian1
, Wang Qionge2, Zhuang Huisheng1,3
(
Abstract ZnPcS2P2
is a phthalocyanine anticancer photosensitive reagent, the ability of ZnPcS2P2
to enhance the CL of Luminol-H2O2-CTAB was studied in an alkaline
medium, and a flow injection chemiluminescent method for the determination of ZnPcS2P2
was established. In optimum conditions, a linear relationship between ZnPcS2P2
and CL intensity is observed at the range of 1.00×10-8-2.50×10-7
mol/L. The detection limit of ZnPcS2P2 is 9.00×10-9
mol/L. The relative standard deviation is 1.23% for 1.00×10-7 mol/L ZnPcS2P2
( n=9). This method is more sensitive than spectrophotometric method.
Keywords Anticancer photosensitive reagent, ZnPcS2P2, Flow
injection, Chemiluminescence, Luminol
叶桦珍1，王建1，王琼娥2 庄惠生1，3
（1福州大学化学化工学院，福州，350002; 2东华大学化学化工学院，3东华大学环境科学与工程学院，上海，200051）
摘要 在碱性介质中，酞菁类抗癌光敏剂二邻苯二甲酰亚胺甲基二磺酸基酞菁锌（以下简写为ZnPcS2P2）增强Luminol-H2O2-CTAB体系的化学发光，据此建立了测定ZnPcS2P2含量的流动注射化学发光新方法。用该方法检测ZnPcS2P2的含量，线性范围为2.50×10-7～1.00×10-8
mol/L ，检测限为9.00×10-9 mol/L，对1.00×10-7 mol/L的ZnPcS2P2溶液进行9次平行测定，其相对标准偏差为1.23%。本法选择性较好，与分光光度法相比，灵敏度提高了1～2个数量级。
关键词 抗癌光敏剂；二邻苯二甲酰亚胺甲基二磺酸基酞菁锌；流动注射；化学发光
1 引言
化学发光法具有仪器简单、灵敏度高、速度快，并可应用于流动注射等优点，已在诸多邻域受到人们的广泛关注。两亲性酞菁衍生物（ZnPcS2P2）是一类用于光动力治疗的抗癌光敏剂。所谓光动力作用是指在敏化剂的参与下，经光激发，使有机体、细胞或生物分子发生机能及形态变化，导致受伤或坏死。这个作用过程必须有氧参与，因此又称为光敏氧化作用。在生物学及医学上称光动力作用、用光动力作用治病的方法称为光动力疗法。目前至少有近20个国家开展光动力疗法的实验和临床研究[1-9]。对该类新药，建立一种准确、灵敏、快速的分析方法，无疑具有重要的意义。由于酞菁本身是个大环化合物，在其环上引入取代基后，易产生多种衍生物，且在合成过程中，易带入少量原料等杂质，所以对酞菁原料药的纯度的检查必须采用适当的分离手段，包括高效液相色谱、高效毛细管电泳等。而对于相关制剂中酞菁含量的测定，则主要考察其制剂中辅料的影响。常用的方法有：分光光度法、原子吸收法（测Zn）等。与上述方法相比，本文建立的化学发光分析法，有一定的选择性，且灵敏度高，速度快，可用于生产过程中中间产物的质量控制。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
2.1.1 仪器
IFFL-D 型流动注射化学发光仪(西安瑞科电子设备有限公司); FA2004型电子天平（上海天平仪器厂）
2.1.2 试剂
二邻苯二甲酰亚胺甲基二磺酸基酞菁锌(以下简称ZnPcS2P2)储备液(1.00×10-3mol/L)：精密称取固体二磺化锌酞菁( 由福州大学功能材料研究所提供 )0.0569g,用水溶解后置于50ml棕色容量瓶中备用，加水稀释至刻度。H202溶液(30%溶液，广东西陇化工厂生产)：使用前用水稀释至所需浓度，用高锰酸钾法标定。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：精密称取分析纯CTAB(北京海淀区新星试剂厂生产)0.0911g，用水溶解后置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，即得0.0100mol/L CTAB储备液。Triton X-100 ：精密量取分析纯Triton X-100 （warenzeichen der rohm&haas company）0.50ml（密度为1.07kg/L），用水溶解后置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，即得0.0214g/ml Triton X-100储备液。十二烷基苯磺酸纳（SDBS）：精密称取分析纯SDBS（上海化学试剂厂生产）0.0871g，用水溶解后置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，即得0.0100mol/L SDBS储备液。Luminol储备液(1.00×10-2mol/L): 精密称取0.0886g固体鲁米诺(A.R级，sigma)，用0.10mol/L的NaOH溶解并稀释至50ml。其它试剂均为分析纯，按一般的分析实验方法配制。实验中所用的水均为二次蒸镏水。
2.2 实验方法
按图1所示流路进行试验，测量峰高定量。数据的采集和处理采用IFFL-D 型流动注射化学发光仪配备的分析软件
图1 反相流动注射化学发光分析流路图
1.Luminol/NaOH 溶液；2.ZnPcS2P2/CTAB 溶液；3.H2O2
溶液
P -蠕动泵（Pump） V-进样阀（Value） F-流通池（flow cell） W-废液（Waste）
HV-负高压(Negative high potential) PMT-光电倍增管(Photomultiplier) R-记录仪（Recorder）
3 结果与讨论
3.1 仪器参数的选择
3.1.1 管道连接方式与注射组分的选择
试验了各种不同的管道连接方式，并分别以ZnPcS2P2/CTAB、H2O2、Luminol/NaOH为注射溶液。结果表明，采用如图1所示的连接方式、以碱性Luminol为注射溶液（用主泵运行）时，无背景干扰，基线平稳，便于读取峰高。故本文选择如图1所示的反相流动注射系统。
3.1.2 光电倍增管负高压的选择
光电倍增管负高压增大，灵敏度随之增强，但噪音也随之增大。本文兼顾仪器灵敏度与稳定性，选择-800V电压。
3.1.3 泵速及运行时间的影响
在H2O2溶液浓度为6.0%, ZnPcS2P2的浓度为1.00×10-7mol/L,鲁米诺浓度为1.00×10-5mol/L的条件下,试验了主泵和副泵的运行速度对发光强度的影响。结果表明：主泵和副泵的运行速度对峰高基本无影响，但对峰形略有影响。综合考虑试剂用量、峰形、操作时间等各种因素，本文选择主泵转速30转/分(相当于流速1.5ml/min)，副泵转速40转/分(相当于流速2.0ml/min)。
在以上选定的泵速下试验了泵的运行时间对发光的影响,结果表明：副泵运行时间对峰高基本无影响，但时间太短会使峰谷重叠，在副泵运行时间大于15s时，峰谷完整，本文选择运行时间为20s。主泵运行时间（进样时间）达4s时，Luminol/NaOH溶液基本充满定量环，本文选择运行时间为5s。
3.2 反应条件的选择
3.2.1 表面活性剂及其浓度的影响
试验了三种表面活性剂对发光强度的影响，结果表明： Triton X-100 (两性表面活性剂)和SBDS(阳离子型表面活性剂)对Luminol-H2O2的发光有较明显的增强作用,且随着表面活性剂浓度的增强而增强，但加入ZnPcS2P2后体系发光无明显改变； CTAB（阳离子型表面活性剂）加入 Luminol-H2O2体系后对发光有所增强，且ZnPcS2P2加入Luminol-H2O2-CTAB体系后发光强度显著提高，故选择CTAB为该实验所用表面活性剂。试验不同浓度CTAB对发光强度的影响，结果如图2所示，本文选择CTAB的浓度为5.0×10-4mol/L。
3.2.2 H2O2浓度的影响
试验了不同浓度的H2O2对体系发光的影响，结果表明：H2O2浓度较低时，发光强度随着H2O2浓度的增大而增大，当其浓度达到6.0%时，发光强度增大趋势不明显。从灵敏度及节约试剂的角度考虑，本文选择H2O2的浓度为6.0%。
3.2.3 Luminol及其介质浓度的影响
试验了不同浓度的Luminol对体系发光的影响，结果表明：Luminol浓度越高，体系的发光强度越大，但是增大的幅度缓慢变小。从发光强度与试剂消耗的角度考虑，本文选择Luminol的浓度为1.00×10-5mol/L。Luminol溶于碱性介质中可得到强的发光，本文选择0.50mol/L的NaOH作为介质。
3.3 工作曲线、检出限及精密度
3.3.1 工作曲线
在所选定的最佳条件下，对不同浓度的ZnPcS2P2溶液进行测定并绘制工作曲线，如图3所示。ZnPcS2P2溶液的浓度在2.50×10-7-1.00×10-8
mol/L之间，体系的化学发光强度（I）与其浓度（C）呈良好的线性关系。线性回归方程为I=102.12C+549.48，相关系数r=0.9976。
图3 ZnPcS2P2工作曲线
3.3.2 检出限与精密度
若定义空白信号的标准偏差的三倍所对应的分析物的浓度为化学发光的检出限，则本法的检出限为9.00×10-9
mol/L（n=11）。对1.00×10-7 mol/L的ZnPcS2P2溶液进行平行测定并计算相对标准偏差，测定结果RSD=1.23%(n=9)
3.4 干扰试验
试验表明。在优化后的实验条件下，当ZnPcS2P2的浓度为2.50×10-7mol/L，允许的测定误差不超过±10%时，发现大于1000倍的葡萄糖和丙三醇，500倍的Na+、K+、Zn2+、SO2+、Cl-，50倍的Mg2+，10倍的Ca2+、Fe3+，1倍的Mn2+不干扰测定。
3.5 回收试验
取福州大学功能材料研究所试制的ZnPcS2P2注射液，采用加样回收的方法
，测得平均回收率为97.1%.
3.6 结论
在Luminol- ZnPcS2P2-H2O2-CTAB体系的化学发光反应中，ZnPcS2P2作为过氧化物模拟酶，起催化剂的作用，依此建立的Luminol-
ZnPcS2P2-H2O2-CTAB体系用于低浓度ZnPcS2P2的测定，具有简便、灵敏的特点。
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