The extraction of paeonol and synthesis of its derivation

Qi Junsheng ^1,2, Cao Yang ² Wang Yuanliang ²，Zhang Wen ³
(¹Chongqing Three Gorges University,Chongqing, 404000; ²College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing, 400044;  ³Chongqing Municipal Science and Technology Commission, Chongqing , 401147)

Abstract Cortex Moutan is the stem and root of Paeonia suffruticosa Andr.which belongs to the paeoniaceae family. It is the effective component of many traditional Chinese medicine. Paeonol is the effective component of Cortex Moutan. It is proved that in modern medicine paeonol has a variety of effects including: antibacteria, antiinflammation, relieving pain, antisensitive, strengthing immune system. It has been widely used in medicine, incense, chemistry. On the one hand, Cortex Moutan is in abundance, majority of which hasn't been made good use of except of export. On the other hand, Paeonol has a good price in the international market. So it is necessary to extract paeonol. In the experiment, extraction of Paeonol from Cortex Moutan by means of alcohol extraction and steam distillation and super-critical CO₂ respectively. It is found that super-critical CO₂ extraction is superior to steam distillation and alcohol extraction and reconstruction of paeonol is a good means which can synthesized a more effective medicine. We have got a new synthesis of its derivation by combining paeonol with As₂O_3.
Keywords paeonol, steam distillation, alcohol extraction, derivation, synthesis

丹皮酚的提取及丹皮酚胂化物的合成

祁俊生^1，2 曹阳² 王远亮² 张 文³
（¹重庆三峡学院 重庆 404000; ²重庆大学生物工程学院 重庆 400044; ³重庆市科学技术委员会 重庆 401147）

2003年5月25日收稿; 科技部重点科技项目（[2001]528 001EP09001）和重庆市教委自然基金（[2001]12）资助项目

摘要 丹皮为芍药属植物牡丹的根皮，丹皮酚是丹皮的有效成分。现代医学研究证明丹皮酚具有抑菌抗炎、镇痛、抗过敏、增强免疫功能等作用，在医药、香料、化学领域具有广泛的用途。由于我国的牡丹皮资源丰富，除部分供出口外，大部分未得到利用，造成资源浪费，而丹皮酚在国际市场售价较高，因此提取丹皮酚十分必要。本实验分别设计了用乙醇提取法、水蒸汽蒸馏法和超临界CO₂萃取法提取丹皮酚。结果发现，乙醇提取法优于水蒸气蒸馏法，超临界CO₂萃取法优于乙醇提取法。同时对丹皮酚进行结构修饰是合成更好疗效药物的有效途径，我们通过天然丹皮酚作为原料与 As₂O₃结合，合成了一种新的衍生物。
关键词 丹皮酚；水蒸气蒸馏法；乙醇提取法； 超临界CO₂萃取法；衍生物； 合成

    牡丹皮是我国特有的资源，重庆三峡库区的牡丹，以川丹皮（重庆垫江、巫溪、巫山）最佳。丹皮为芍药属植物牡丹的根皮，牡丹根皮作药，据：《本草纲目》记载，气味辛寒、无毒、主治寒热、中风症、惊痛邪气、除症坚淤血留舍肠胃、安五脏、疗痛疮、久服轻身益寿。丹皮酚是丹皮的有效成分，它在牡丹根中的含量占根皮的 4～5%，在根须中占6～7.5%。丹皮酚药理活性广泛：镇痛、解热、解痉、抗过敏、消炎、抑菌、免疫、调节、活血、化淤等。近代药理和临床研究指出：（1）丹皮酚有明显保护缺血灌注心肌SOD活性和治疗高血压。（2）丹皮酚可以透皮吸收，使毛细血管扩展，红细胞流速加快等作用，所以丹皮酚可以皮肤给药，使局部循环加快。（3）丹皮酚对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄菌、链球菌，具有明显抑制作用。（4）增加肌体非特异性免疫，抑制红细胞渗透和溶血作用。（5）对湿疹、搔痒、皮炎、寻麻疹等多种皮肤病疗效甚佳。因此丹皮酚可用于多种日用化妆品、牙膏、香皂、浴液、生发液 、医用消毒纸、妇女、婴儿卫生用品、食品添加剂、保健茶品、饲料添加剂 ^[1] 。 丹皮酚熔点49.5-50℃。极易挥发，其含量的高低直接影响药品疗效，因此合理提取丹皮酚并提高其含量对提高药效有重要的意义。
    目前国内丹皮酚的提取一般用水蒸气蒸馏，或溶剂法，所用溶剂主要是水和乙醇，但提取产品需经过多次重结晶提纯^[2-5]。由于丹皮酚水溶性差，在理论上可以用超临界CO₂有选择性地从丹皮中提取丹皮酚而不破坏丹皮酚的结构，不影响丹皮酚的质量，而且CO₂易回收，操作成本较低，这是一种优秀的丹皮酚提取溶剂^[6]。但超临界提取装置设备价格昂贵，所以不宜展开大规模的提取。同时对丹皮酚药用成分进行结构修饰，是创造具有更好疗效药物的有效的途径之一，As₂O₃是传统中药砒石的主要成分，有巨毒，以往人们过多考虑它对有机体有害的一面，如毒性甚至致癌作用而应用较少，但从我国发现其具有良好的抗急性早幼粒白细胞病作用以来，As₂O₃抗癌功能日益引起人们的重视。大量临床研究资料表明，在临床用药剂量下，As₂O₃的毒副作用较小，且为可逆的^[7-11]。 据报道，通过动物试验证实，As₂O₃不仅对白血病有明显治疗作用，还对其它腹水型和实体瘤有效^[12]。基于这种考虑，我们将天然丹皮酚的结构进行了修饰，分别用了两种方法在羟基的对位进行反应，接入含有胂的基团，合成新的化合物。反应式如下：

表1 因素水平表

表2 L₉（3⁴）正交试验数据

表3 方差分析

1.3.2 乙醇提取法
1.3.2.1醇提法 取丹皮粗粉30g，加一定量的95%乙醇，在不同的温度下进行回流后，对溶液进行过滤，然后将滤液进行蒸馏，得粗结晶物。接着将粗结晶物溶于95%乙醇，加热，趁热过滤，除去不溶物质和有色杂质，然后对滤液进行再次蒸馏，得丹皮酚结晶物。
1.3.2.2加酸醇提法 取丹皮粗粉30g，加一定量95%乙醇及1mol/l的HCl15ml，其它实验步骤同醇提法。
1.3.2.3加碱醇提法 取丹皮粗粉30g，加一定量95%乙醇及1mol/l的NaOH15ml，其它实验步骤同醇提法。
1.3.2.4加碱酸中和醇提法 取丹皮粗粉30g，加一定量95%乙醇及1mol/l的NaOH15ml，浸渍2小时后加1mol/l的HCl30ml在不同的温度下进行回流后，对溶液进行过滤，然后将滤液进行蒸馏，得粗结晶物。接着，将粗结晶物溶于95%乙醇，加热，趁热过滤，除去不溶物质和有色杂质，然后对滤液进行再次蒸馏，得丹皮酚结晶物。
1.3.2.5正交试验探讨醇提法的最佳工艺 取丹皮粗粉30g，采用L₁₆（4⁵）正交表。实验安排见表4。

表4 因素水平表

    因素A和因素C对丹皮酚提取率的影响具有显性，而因素B和因素D在乙醇提取法中无显著影响，因此，通过正交试验和正交试验的方差分析可以得出结论：丹皮酚最佳工艺为加碱酸中和醇提法。加入丹皮粉末6倍量的乙醇，在45℃的温度下提取2h。
1.3.2.6萃取工艺的正交试验设计 精确称量若干份丹皮粉末1.0000克，分别装入萃槽中，调节萃取温度，萃取压力，收集管温度，然后打开二氧化碳供给阀，开始萃取，用无水乙醇吸收萃取物。萃取结束后，将提取液移入50mL容量瓶，加入乙醇至刻度；移取1.0mL于50mL容量瓶，所得溶液在274nm处用分光光度计测定丹皮酚的吸收度，利用标准曲线可计算出丹皮酚的含量。
    为了找出利用超临界二氧化碳从牡丹皮中提取丹皮酚的最佳工艺条件，我们选用了压力、温度、萃取时间做三因素三水平的正交试验。其因素与水平见表5。

表5 正交试验的水平与因素

    通过正交试验和正交试验的方差分析可以得出结论F_0,1(2,4)=4.32，温度因素和时间因素的F_i值都大于4.32，表示两者对实验结果显著相关，而压力的选择对实验结果没有显著影响。最佳实验条件为：A₃B₁C₃即温度在40℃，压力在150 Bar，时间为60 min时，丹皮酚含量最高15.0mg，提取率为98.0%（此时收集管温度为90℃）。因各萃取条件的数据在边界上，为更加精确地确定萃取条件，再次选定温度，压力，时间进行三因素，三水平的正交试验，见表6：

表6 正交试验的水平与因素

    按相同的实验方法进行萃取，结果见表7：

表7 正交试验结果

表8 正交试验的方差分析

    可见萃取的最佳条件为：A₃B₁C₃即温度在45℃，压力在100 Bar，时间为75 min时，萃取效果最佳。丹皮酚含量1.45%，提取率为94.1%（此时收集管温度为90℃）。
1.3.2.7 牡丹皮中丹皮酚总量的提取 在萃取温度为45℃，萃取压力为100 Bar，每隔15 min收集一次，连续收集，共13次（共15*13=195min），用溴量滴定法检验馏液直至未有丹皮酚被提取后，测得丹皮酚含量为15.3 mg，含量为1.53%。
1.4 丹皮酚结构鉴定
    用碘仿实验鉴别甲基酮，有黄色沉淀生成；用三氯化铁溶液鉴别酚羟基，显紫色，表明有酚羟基；丹皮酚为熔点47.5-49.5℃，文献值^[5-^7]为49.4-50℃；IR（KBr压片）g_max(cm^-1):3074（Ar-H），2944（-CH₃），2850，1625（C=O），1570，1467（Ar），1467（-Ar-OCH₃）；用CDCl₃ 作为溶剂，四甲基硅为内标（TSM），测得丹皮酚的¹HNMR值（d）： 6.46-7.88 (d. 3H Ar-H)， 3.94（s.3H CH₃O-），1.82（s. 3H CH₃CO-）， 4.60（s. 1H -OH）。通过丹皮酚主要官能团鉴别及熔点测定，测得产物结构式与文献结构式吻合^[5-7]。
1.5 丹皮酚砷化物（2-甲氧基-5-乙酰基-4-羟基苯砷酸）的合成
1.5.1 合成方法
    方案1：在带搅拌、温度计和回流冷凝器的500ml反应瓶中加入25％HNO₃192.1g和0.28gKI,搅拌，加热至38℃，缓缓加入69.3gAs₂O₃,加毕升温至90-95℃，反应1.5小时，至反应完全不防出氧化氮为止，真空浓缩至粥状，制得的砷酸留反应瓶中待用。在的反应瓶中加入106.24g(0.64mol)丹皮酚，瓶上装有搅拌器、温度计及连接管以及连接向下的冷凝器。将烧瓶浸入油浴中，迅速将油浴热至155-160℃，开动搅拌器，其速度足以保证将混合均匀为止。当瓶内温度达到140℃，开始沸腾，有水和及少量丹皮酚开始蒸出。让蒸馏进行到已经收集约12ml 水为止。（通常约需一小时）瓶内温度上升达146℃，然后把向下的冷凝器换以回流冷凝器，使反应继续进行。从瓶内的温度第一次达到140℃时起共经4小时为止，回流冷凝器装上后瓶内温度慢慢降低到141℃或142℃，反应混合物开始变浓状。在瓶内混合物已部分冷却后，一面倒入800ml水内，一面搅拌，使反应混合物尽可能完全溶在水中。搅拌下分多次加入粉碎了Ba(OH)₂．8H₂O使对石蕊呈弱碱性，以除去过多的砷酸为止；当此点达到以后，溶液变成粉红色。若实验进行正常，则需140-160 g的Ba(OH)_2·8H₂O，将Ba₃(AsO₄)过滤去后，用水浸洗三次，滤液及洗液合并，用稀H₂SO₄调整无Ba²⁺及 SO₄^2-,滤去BaSO_4，用热水洗，滤液及洗液合并得2-甲氧基-5-乙酰基-4-羟基苯砷酸溶液。减压蒸发至600ml，以NaOH中和到对石蕊成中性，滤清液减压浓缩至有相当多的结晶析出（蒸发到溶液被晶体遮满为止），然后用2.5倍乙醇处理，混合均匀后放置过夜，次日滤出，以乙醇冲洗，放在80℃烧瓶中干燥，得产品。将滤液在浓缩，并用乙醇沉淀，又可得第二批产品，将两批产品合并。产率为33.0％。测定其熔点大于300℃。
    方案2：硝化反应 在装有滴液漏斗、温度计、搅拌器1000ml三颈瓶中将.39.84g丹皮酚溶于含有10.8gNaOH的160ml溶液中，搅拌下加入21gNaNO₃,溶于50ml水中，混合物置于冰盐中冷至-5℃-0℃，20分钟内滴加0.5mol浓硫酸和70ml水配成的溶液，维持反应温度-5℃-0℃，待有青铜色析出，继续反应2小时，抽滤，冰水洗涤沉淀，干燥后得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯乙酮（I）黄色固体。还原反应 在500ml三颈瓶装上滴液漏斗和温度计，向瓶（装有I化合物）内投入10％Na₂S溶液224ml(0.3mol), 温度控制在40-50℃还原，1小时加完反应毕，将反应液静置数小时，滤出沉淀，冰水洗涤，完全后晾干，得粗品。粗品微热溶于水液中，此时溶液PH=3,滤出不溶物，活性炭脱色，加热至沸，小心用Na₂SO₃冰水洗涤，空气中晾干，注意避光，得2-羟基-4-甲氧基-5-氨基苯乙酮（II）白色针状晶体。重氮化反应 在带温度计、搅拌和滴液漏斗的反应瓶溶液中加入18.1g化合物II，盐酸0.15mol室温搅拌，使充分成盐，冷却至0℃，滴加30％NaNO₂水溶液50ml,控制温度不超过5℃，以淀粉KI试纸检查至氮化终点，得至氮盐溶液。砷化反应 将液在搅拌下，缓缓加入含有几滴CuSO₄溶液的Na₃AsO₄ 液中，温度控制不高于10℃，得2-甲氧基-5-乙酰基-4-羟基苯砷酸钠液。加稀HCl酸化过滤，滤液中和至中性，真空浓缩，放置过夜，过滤，得粗品。粗品溶于水，加稀HCl酸化，冷却至10℃,放置过夜，过滤，冰水洗，干燥得产品。产率24.1％。测定其熔点大于300℃。

2 结果与讨论
    由表3的方差分析结果表明： 因素B和因素C对丹皮酚提取率的影响具有显著性，而因素A在水蒸气蒸馏法中无显著影响。因此，我们可以得出结论：加一定量的硫酸钠和延长温浸时间可以提高丹皮酚的提取率。由表2可知：取丹皮粉末，加15倍的水，加10%的硫酸钠，温浸2小时，用水蒸气蒸馏，收集蒸馏液，冷藏过夜，滤过，得结晶物，滤液再加入上述的硫酸钠，进行重蒸馏，收集蒸馏液，冷藏过夜，滤过，得结晶物，将两次结晶物合并，于40℃干燥，即得产品。
    由方差分析结果表明 因素A和因素C对丹皮酚提取率的影响具有显性，而因素B和因素D在乙醇提取法中无显著影响，因此，我们可以得出结论：丹皮酚最佳工艺为加碱酸中和醇提法。加入丹皮粉末6倍量的乙醇，在45℃的温度下提取2h。
    由综合分析结果表明，经酸、碱水解得醇提取丹皮酚含量普遍比水蒸气蒸馏法高，可能是由于酸、碱增加了丹皮酚原甙等得水解，游离出更多的丹皮酚，其中碱水解过量然后用酸中和醇提取法提取最完全，丹皮酚含量最高，因此在投料量大的工业生产中，酸、碱水解效果较好。
    合成丹皮酚胂化物（2-甲氧基-5-乙酰基对羟基苯胂酸）的产率分析：第一种将丹皮酚直接砷化的方案比第二种将丹皮酚依次经过硝化反应、还原反应、重氮化反应、取代反应的方案的效果更好，但两种方案的产率都偏低，这可能是由于第二种方案的中间反应步骤过多，同时丹皮酚由于分子本身的空间位阻大，活泼的基团多，可能发生的副反应就多，分离的难度就大。
    2-甲氧基-5-乙酰基对羟基苯胂酸的结构表征： ¹HNMR（CDCl₃）d: 7.87[1H,Ar-H（酚羟基邻位的氢）]，6.43[1H,Ar-H(乙酰基邻位的氢)]， 4.35（1H，-OH），3.86-3.93（3H，d CH₃O-），2.63（3H，s，-COCH₃）。IR（KBr压片）g_max(cm^-1)：1621(C=O);3430(-OH); 1255,1022,2920(-OCH₃);2974,2849(-CH₃); 845,820,660,630(-AsO₃H₂)。元素分析C₉H₁₁O₆As 计算值(%) C 37.24，H 3.79，实测值(%) C 37.45，H 3.72，理论计算该化合物含砷为25.1%，实测值为24.9%。从以上知，丹皮酚胂化合物的结构是2-甲氧基-5-乙酰基-4-羟基苯胂酸。

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