Wang Ning, Wang Hongen, Hou Shifeng, Sun Qingshu
(Department of Chemistry, Jining Medical College, Jining, Shandong Province, 272013, China)

Abstract The immobilization of DNA (deoxyribonucleic acid) on solid substrate is an essential step for any application in the field of DNA microarrays. In this paper, the covalent immobilization of Amino-terminal DNA on self-assembled monolayers of carboxyl-terminated silane by cross linker was investigated. Several vinyl-terminal silane SAMs with various chain lengths were formed on silicon surface, and the vinyl groups were oxidized to carboxyl groups and DNA were linked to the carboxyl groups by chemical linkers.The X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), contact angle measurement, and UV spectrum were used to characterize the changing properties of the surface during the DNA array fabrication. The results indicate that immobilization of amino-terminal DNA to a carboxyl-terminal SAMs surface is a choice method to build DNA microarrays. The longer length of silane SAMs chains, the higher density of the immobilization DNA. The surfaces functionalized with carboxylic acid show the lowest nonspecific binding, due to the repulsion of the negatively charged surface.
Keywords Silane, Self-assembled monolayers, DNA.

王宁，王洪恩，侯士峰, 孙勤枢
(济宁医学院化学教研室,山东省，济宁市，272013)

    制备DNA传感器或基因芯片最重要的环节是基底表面单链DNA探针固定 [1-3]，化学键合技术是常用的固定DNA方法^[4]。如胺基在异硫氰和醛基活化表面的键合，羧基或磷酸基DNA在胺基化表面的固定等^[5-7]。由于DNA链和表面之间静电引力的作用，胺基化SAMs表面容易引起DNA非键合性吸附^[8,9]，从而影响DNA探针和芯片的灵敏度。而羧基SAMs表面虽可有效阻止非键合DNA的吸附，但需要特殊的试剂。本文利用表面反应技术，首先在硅和石英表面形成末端含乙烯基团的单分子自组装膜SAMs，然后将乙烯基转变成羧基^[10,11]，并进一步研究了末端胺基化的DNA在羧基SAMs表面的键合过程。通过控制硅烷SAMs的碳链长度，得到不同碳链长度末端含羧基SAMs。研究发现，DNA在含羧基的长链硅烷SAMs表面键合后的表面密度较高，同时非键合DNA的吸附较少。

1．实验部分
1.1试剂与仪器
    末端含双键的硅烷试剂：allytrichlorosilane (ATCS)，7-octenyltrichlorosilane (OTCS)， 10-undecenyltrichlorosilane(UTCS) 和 docosenyltriethoxysilane (DTES) 均购自 Gelest, Int. N-ethyl-N'(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide (EDC)，2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES)和N-hydroxysulfosuccini-mide(NHSS) 购自Aldrich. DNA由 Alpha DNA Co.公司提供，为末端氨基化的含十八个碱基的单链DNA (NH₂-ssDNA),其碱基顺序和结构如下:5'-Amine-C₆TA CAG GTC ATG TAA CTT-3c，其他化学试剂购自Acros，未经进一步提纯.
    X-ray photoelectron spectra (XPS) 在Hewlett-Packard 5950A ESCA spectrometer 上进行。椭圆光谱数据在Rudolph Research ellipsometer (model 43603-200E)上进行，使用He-Ne 激光器，每个样品测量五次后取平均值。紫外吸收光谱在U3501-Spectrophotometer ( Hitachi )上进行。基底表面水接触角的测量在JJC-II 接触角测定仪上进行，二次蒸馏去离子水作为测定液。
1.2 基片制备   
    把硅片或石英玻璃切割成1.5cm×2cm见方的小片，用二氯甲烷清洗后再浸入新配制的Piranha 溶液[3:1 v/v H₂SO₄ 和 H₂O₂ (30%)]，于90℃处理20分钟。用去离子水和乙醇超声洗涤后，氮气氛围干燥后使用。
    基片表面硅烷SAMs按以下步骤制备: 250ml 烧瓶中加入150ml含2%硅烷的甲苯溶液，干净的硅片或石英基片放入特制的冷凝管中回流，硅烷随甲苯蒸发，接触基片表面即形成硅烷SAMs。回流反应24小时后，取出基片，依次用氯仿、乙醇、去离子水洗涤，再在光谱纯甲醇中超声5分钟，放入100℃烘箱干燥 2小时后即可在基片表面形成致密的硅烷SAMs。我们发现气相法比液相法更适合制备高密度的硅烷SAMs^[11]。按照 Whitesides's 方法^[12]，将基片放入含KIO₄，KMnO₄和 Na₂CO₃ 混合溶液中反应48-72小时，SAMs表面的乙烯基基团即可转变成羧基基团。其中，ATCS SAMs 转变成含2个碳的羧基SAMs：C₁-COOH SAMs，OTCS SAMs变成C₆-COOH SAMs,，UTCS SAMs 为 C₉-COOH SAMs, DTES 变成 C₂₀-COOH SAMs.。接触角结果表明，对以上四种硅烷SAMs，经48小时反应后，其表面接触角均可达到最低值，表明表面氧化反应可在48小时完成。
1.3 DNA的固定
    DNA在羧基SAMs表面的固定按以下过程进行：胺基DNA用含5mmol^.L^-1 EDC、0.33 mmol^.L^-1NHSS和0.1 mol^.L^-1MES的缓冲溶配制成50nmol^.L^-1的稀溶液。将5 ml 上述DNA溶液滴到羧基化的硅片或石英玻璃表面上，20℃反应2-4小时即得到表面固定有DNA单分子层的基底表面。

2. 结果与讨论
2.1 表面接触角测定  
    接触角的测量在新制备的基底表面进行，水的接触角随表面基团不同而发生变化。从表1可以看出，四种乙烯基硅烷SAMs的接触角随碳链的增加而增加，这是由于硅烷SAMs结构随碳链增长而由不规则到致密有序所至。一般而言，长链硅烷容易在硅和石英玻璃表面形成致密均匀的SAMs，这和其他作者的结果类似^[12-14]。由于乙烯基和烷基均为疏水性基团，大的接触角反映了SAMs膜的均一结构，低的接触角表明SAMs结构的不规则性。

表1 水在各种表面的接触角数值（º）
Table 1 The contact angles of water on various surfaces ( º )

2.3 DNA探针的紫外吸收光谱
    固定在石英玻璃表面的DNA层可用紫外光谱进行表征^[5,15]。图2为石英表面四种羧基硅烷SAMs键合DNA后的紫外吸收光谱图。在260nm处的最大吸收峰是DNA的特征吸收峰。虽然具体的吸收峰强度和表面DNA密度的定量关系还有待进一步的研究，但吸收峰的强度和DNA层的表面密度相对应。在C₁-COOH, C₆-COOH, C₉-COOH 和 C₂₀-COOH SAMs表面不同的吸收强度表明DNA在表面的密度不同。从吸收峰的高度可以发现C₉-COOH和C₂₀-COOH SAMs表面DNA密度高于在C₁-COOH 和 C₆-COOH SAMs表面，这些结果和接触角与椭圆光谱数据（表2）相对应。表明C₉-COOH 和 C₂₀-COOH SAMs表面致密有序的结构有助于形成高密度的DNA单分子层。因为C₂₀-COOH 和 C₉-COOH SAMs具有较致密的结构，表面羧基基团几乎全部暴露在表面；因此，立体阻隔效应较小，表面反应效率高，这有利于DNA在表面的固定。而短链羧基SAMs膜（如C₁-COOH SAMs）的不规则结构导致部分疏水性的烷烃基团暴露在膜的表面，而部分羧基则被隐藏在膜的内部，从而降低了表面反应效率而影响随后DNA的固定。因此，在C₁-COOH 和 C₆-COOH SAMs 表面，DNA的表面密度小，亲水性较低。

    一般而言，由于含阴离子电荷的DNA链和带正电荷胺基之间的相互吸附作用，DNA容易在胺基化表面形成非键合性吸附^[16]。这种非键合物理性吸附的DNA不能参与其后的作用过程，从而降低DNA探针的灵敏度。因此，许多研究致力于避免键合过程中的物理吸附。我们发现，由于羧基和DNA链带有相同的负电荷基团，DNA链和羧基之间存在静电斥力，因而羧基SAMs表面可有效阻止DNA的吸附。SAMs表面非键合吸附的DNA，不能用普通缓冲溶液洗去，但可用高浓度电解质洗脱，图3是经过洗脱处理（依次用50 mmol^.L^-1磷酸钠，1mol^.L^-1 NaCl 和pH6.5 SPSC缓冲液洗脱）前后的紫外光谱图。我们可以发现C₉-COOH 和C₆-COOH 表面260nm左右的吸收峰基本保持不变，表明在C₉-COOH 表面非键合DNA较少。进一步研究表明，在C₆-COOH，C₉-COOH和C₂₀-COOH SAMs 表面表面非键合DNA均低于表面DNA总量的10%。作为对比实验，C₁-COOH SAMs 和胺基SAMs表面非键合吸附的DNA均大于10%。表明长链羧基SAMs表面可较好的阻止非键合DNA的吸附。

图3 非键合吸附DNA洗脱前后的紫外吸收光谱
Figure 3   UV spectra of DNA monolayer formed on quartz surface before and after removed the nonspecific adsorption DNA.

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