Tolerance of Sinonovacula constricta(Lamarck) to three organophosphorous pesticides
Xue Xiuling, Yuan Dongxing, Yu Ang
(Key Laboratory of Marine Environmental Science, Ministry of Education, Environmental Science Research Center, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

缢蛏对三种有机磷农药的耐受性研究

薛秀玲 袁东星 郁昂
(海洋环境科学教育部重点实验室，厦门大学环境科学研究中心，福建　厦门361005)

2004年4月10日收稿；国家自然科学基金资助项目（20277030）

摘要  本研究分别采用常规方法和逐步加大剂量反复染毒法，测定了缢蛏[Sinonovacula constricta(Lamarck)] 对三种常用有机磷农药（敌敌畏、乐果、马拉硫磷）48小时的LC₅₀。与常规方法相比，逐步加大剂量反复染毒后，三种有机磷农药对缢蛏的LC₅₀值均有不同程度的增加，说明缢蛏对三种有机磷农药分别产生了不同程度的耐受性。实验结果显示，三种有机磷农药中，缢蛏对乐果产生的耐受性最大，敌敌畏次之，马拉硫磷最差。该实验结果可作为相应有机磷农药急性毒性实验的补充，也可作为其慢性毒性实验的参考。研究还从理论上讨论了有机磷农药的分子结构、性质与缢蛏耐受性之间的关系。
关键词  缢蛏　敌敌畏　乐果　马拉硫磷　耐受性 LC₅₀

    有机磷农药易降解、残留期短、毒效大，因而得到广泛应用；但由于其使用量大，在环境中的残留量亦不容忽视。其通过大气迁移和水迁移，尤其是水迁移进入海洋，对海洋渔业、水产养殖产生一定的威胁。有研究表明，部分有机磷农药对水生生物有强烈的短期毒性效应。耐受现象是生物的一种保护反应，国内外已有很多有关大鼠对有机磷农药的耐受性研究^［1］，但是关于贝类对有机磷农药耐受性的研究却很少。缢蛏俗称蛏子，是我国滩涂贝类养殖中的当家品种。基于受污农田灌溉水的间歇性排放规律、滩涂海水的潮汐规律和缢蛏的穴居生活方式，可以认为缢蛏对农药的接触是小剂量、间歇性、长期的，故有必要研究缢蛏受有机磷农药反复污染而产生的耐受性。本文研究了常规实验条件下三种常用的有机磷农药（敌敌畏、乐果、马拉硫磷）48小时的LC₅₀值，以及缢蛏在预先逐步加大三种有机磷农药染毒剂量之后，48小时的LC₅₀值；比较了缢蛏对三种有机磷农药的耐受性，并讨论了有机磷农药分子结构、性质与耐受性之间的关系，为深入了解这些有机磷农药对滩涂养殖生物的毒性效应提供了相关数据。

1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
    市售农药：80%敌敌畏乳油（浙江巨化股份有限公司兰溪农药厂）、40%乐果乳油（沈阳新城化工有限公司）、45%马拉硫磷乳油（南海市大兴农药有限公司）、有机磷农药乳化剂0201B (邢台市蓝天精细化工有限公司)、二甲苯（上海光华化学试剂厂，进口分装）；有机磷农药的浓度按其有效成分计算。
    化学试剂：乙酸乙酯（色谱纯，Tedia Co.，USA）；无水硫酸钠（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；内标物磷酸三丁酯(分析纯，上海化学试剂公司)
    CP3800气相色谱仪（美国Varian公司），带脉冲火焰光度检测器，配磷滤光片。色谱柱为HP-50＋毛细管柱（30m×0.32mm，涂层厚0.25mm），进样口温度300℃，不分流进样。检测器温度300℃；氢气流速16mL/min，空气1流速17mL/ min， 空气2流速10mL/min。载气为高纯氮气，流速1.0mL/min。柱箱升温程序：初始温度80℃，以2℃/min升至90℃，再以30℃/min升至260℃，保持8min；进样量1mL。
1.2 实验材料
    实验所用缢蛏购自厦门龙海西边养殖区，一年龄，挑选健康活泼，个体大小、重量均一的缢蛏，壳长4～6cm，体重4.5～6.5g。三角褐紫藻（phaeodactylum tricormatum）在本实验室接种和培养。培养液采用f/2营养盐配方^［2］，培养温度20±0.5℃；光照4000lx，光暗比: 12h:12h。
1.3 条件和方法
    分别配制一定浓度的敌敌畏、乐果、马拉硫磷储备液、助剂储备液（乳化剂、溶剂二甲苯），4℃避光保存。三种有机磷农药的实验方法相同，以下统一以“农药”为名加以说明。
    暂养、驯养及试验用水均为天然海水，经沉淀、砂滤后使用。盐度为23.5～24.5，pH为8.2，水温21－23℃。缢蛏先于盛20L砂滤海水的玻璃养殖箱中驯养3天，驯养期间投喂三角褐紫藻，试验前1天停止投喂。整个实验过程中持续往养殖箱内充气。
1.3.1 有机磷农药对缢蛏LC₅₀的常规测定方法
    用砂滤海水分别将单个农药配制成0.5、5、20、60、100mg/L系列浓度，同时设1个空白对照组，1个助剂对照组（按农药乳油实际配比，乳化剂浓度12.5mg/L、二甲苯浓度137.5mg/L）。随机取驯养过的缢蛏分为7组，每组25只。每天更换相同浓度的农药、助剂溶液，并清除排泄物。观察缢蛏的形态与反应，轻触时，进、出水管不缩回，双壳不闭，即视为死亡。及时捞出死亡个体，分别计算三种有机磷农药对缢蛏48小时的LC₅₀。
1.3.2 逐步加大剂量反复染毒之后有机磷农药对缢蛏LC₅₀的测定方法
    选取驯养过的缢蛏，随机将缢蛏分为5组，其中有1个空白对照组，1个助剂对照组，每组25只。空白对照组每天更换砂滤海水，助剂对照组、农药实验组逐步加大剂量染毒。先将缢蛏分别置于助剂对照组（乳化剂浓度0.075mg/L、二甲苯浓度0.7mg/L）和农药实验组（除助剂外，另加农药0.5mg/L）中染毒2天；第3、4天将农药浓度提高至1.5mg/L，即增至3倍，助剂浓度亦按比例增加；第5、6天换清洁海水，并于第5天喂三角褐紫藻。第7、8天再次提高农药浓度至6mg/L染毒两天，助剂浓度亦按比例增加；第9、10天恢复清洁海水，并于第9天喂食。在逐步加大剂量反复染毒实验的过程中，观察、记录缢蛏的生理反应。
    由于在农药浓度为0.5mg/L和5mg/L时，缢蛏无死亡现象，故本实验在缢蛏逐步加大剂量反复染毒之后，只设置1个高浓度助剂对照组（乳化剂浓度12.5mg/L、二甲苯浓度137.5mg/L），3个高浓度农药实验组，农药浓度分别为20、60、100mg/L，进行急性毒性实验。在第11天，将逐步加大剂量反复染毒之后的缢蛏分别置于农药浓度为20、60、100mg/L的砂滤海水中，计算经过逐步加大剂量反复染毒实验之后，三种有机磷农药对缢蛏48小时的LC₅₀。
1.3.3 缢蛏体内有机磷农药含量的测定
    缢蛏致死后，立即解剖，取出软组织，绞碎。准确称取10g样品于80mL离心管中，依次加入适量无水硫酸钠、适量内标物磷酸三丁酯和15mL乙酸乙酯，超声波萃取10min，于3000转/min离心5min，取出上清液，往残渣中再加入15mL乙酸乙酯，超声波萃取10min，离心5min，合并两次上清液，倒入装有无水硫酸钠的漏斗，以少量乙酸乙酯洗涤漏斗，收集滤液于50mL收集管中，于50℃水浴中用氮气吹脱溶剂至约0.5mL。转移入样品瓶，用乙酸乙酯定容至1mL，供气相色谱测定有机磷农药。三种农药敌敌畏、乐果、马拉硫磷的方法检测限分别为：2、0.2、0.2ng/g湿重。
1.4　数据处理 
    半数致死浓度LC₅₀的计算方法采用直线内插法^［3］。

2 结果
2.1 逐步加大剂量反复染毒期间缢蛏的行为观察
    空白对照组的缢蛏反应灵敏，轻触时进、出水管伸缩快，双壳迅速紧闭。整个实验过程中，助剂对照组的缢蛏与空白对照组相比，其反应灵敏度基本相同，说明助剂对缢蛏没有毒性效应。而含有不同浓度的农药组，情况则不尽相同。浓度为0.5mg/L的各农药组的缢蛏反应灵敏，与对照组的情况基本一致；当加大有机磷农药浓度至1.5mg/L时，发现各组缢蛏对刺激的反应灵敏性均有不同程度的下降。相对于乐果和敌敌畏，置于含马拉硫磷水体中的缢蛏，被轻触时，水管伸缩不够敏捷，闭壳时间较长。于第5、6天更换清洁海水，并喂以三角褐紫藻后，再次轻触，发现不同农药组的缢蛏对外界刺激的反应灵敏性有不同程度的恢复，但是与对照组缢蛏相比，反应尚差。第8天，当有机磷农药浓度增至6mg/L时，发现马拉硫磷组的缢蛏反应较迟钝，轻触时，进、出水管伸缩较慢，闭壳时间也较长；而敌敌畏组的缢蛏对刺激的反应较敏捷，但仍比对照组的差，乐果组的缢蛏反应则与对照组的基本相同。第9、10天，再次更换清洁海水，并喂以三角褐紫藻后，发现敌敌畏组的缢蛏对刺激的反应灵敏性恢复正常，与乐果组和对照组的缢蛏一样，轻触双壳迅速紧闭，进、出水管立即缩回。但是马拉硫磷组的缢蛏对刺激的反应仍较迟钝。
2.2 常规LC₅₀和逐步加大剂量反复染毒后LC₅₀的测定结果
    采用直线内插法分别计算常规LC₅₀和预先逐步加大剂量反复染毒后，有机磷农药对缢蛏48小时的LC₅₀，结果见表1。助剂对照组在48小时的急性毒性实验中，缢蛏的死亡率为1.3%，故助剂对测定三种有机磷农药对缢蛏的LC₅₀值的影响可以忽略。

表1　缢蛏经逐步加大剂量反复染毒后与按常规染毒测得的LC₅₀（mg/L）

注：DLC₅₀为耐受实验后LC₅₀减去常规LC₅₀。

2.3 缢蛏体内蓄积的有机磷农药含量
    染毒致死的缢蛏，分析其体内有机磷农药的含量，其中，空白对照组的缢蛏体内未检出上述三种有机磷农药，其它结果见图1。内标物磷酸三丁酯的回收率在60%～110%之间。

图1 不同有机磷农药浓度砂滤海水中缢蛏体内的农药蓄积

3.讨论
3.1 缢蛏对三种有机磷农药耐受性的比较
    本研究中，缢蛏经过逐步加大三种有机磷农药（敌敌畏、乐果、马拉硫磷）剂量染毒后，均产生了不同程度的耐受性，所测48h的LC₅₀均比常规方法的测定值大（见表1）。其中缢蛏经逐渐加大马拉硫磷剂量染毒后，△LC₅₀值最小，敌敌畏次之，乐果最大。这说明经加大剂量染毒后，缢蛏对马拉硫磷产生的耐受性较小，所测LC₅₀与常规LC₅₀结果接近。至于乐果，常规实验对耐受实验后的△LC₅₀值最大，说明在反复加大剂量染毒过程中，缢蛏对乐果逐渐适应，产生了较强的耐受性，以致在其后的急性毒性实验中显示出较高的LC₅₀值。文献^［1］曾报道了用八甲磷、乙拌磷低剂量反复染毒后的小鼠，比未染毒小鼠的LC₅₀有所增加。这些结果都表明，反复染毒后生物对有机磷农药会产生一定的耐受性。
    参考我国的基于鱼类48h急性毒性结果的农药分类标准^［4］，LC₅₀＜1mg/L为高毒农药，1mg/L＜LC₅₀＜10mg/L为中等毒性农药，LC₅₀＞10mg/L为低毒农药，本研究所用的三种有机磷农药对缢蛏均属于低毒农药。
3.2 缢蛏对三种有机磷农药的耐受力与其体内蓄积含量的关系
    分析图1可知，缢蛏染毒致死后，体内有机磷农药的含量随着饲养水体中有机磷农药浓度的增加而增加，但当水体中农药达到一定浓度后，缢蛏体内蓄积的农药含量趋于稳定值。饲养水体中农药浓度为20mg/L时，死亡缢蛏体内蓄积的乐果、敌敌畏、马拉硫磷均较少，而浓度分别为60mg/L和100mg/L时，缢蛏体内蓄积的乐果和敌敌畏的量基本不变，分别为80mg/g和10mg/g，由此推测致死时其体内蓄积的乐果和敌敌畏的量已达到饱和。饲养水体中马拉硫磷的浓度分别为20mg/L和60mg/L时，缢蛏体内蓄积的马拉硫磷量基本相同，约为3.5mg/g。但当马拉硫磷浓度增至100mg/L时，缢蛏体内农药量又有所增加，对此结果的解释尚在进一步研究中。比较三种有机磷农药，发现水体中各农药浓度相同时，缢蛏体内蓄积的农药量的大小顺序：乐果＞敌敌畏＞马拉硫磷。缢蛏染毒致死时体内蓄积的农药含量不同，是因为缢蛏在逐步加大剂量染毒时对不同的农药产生的耐受性不同。缢蛏对马拉硫磷几乎没有耐受性，死亡时体内马拉硫磷的含量相对最低，说明马拉硫磷对缢蛏的毒性最大，毒性作用带很窄。缢蛏对乐果的耐受性最大，即体内蓄积较高浓度时才致死，说明乐果的毒性相对最低，毒性作用带较宽。
3.3　缢蛏对三种有机磷农药的耐受性与有机磷农药分子结构的关系
    缢蛏对三种有机磷农药的耐受力与农药分子的结构有一定关系。有机磷农药进入机体后，主要作用是抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性。乙酰胆碱酯酶是存在于神经末梢、肌神经接点和红细胞中的酶，它对神经冲动释放出的乙酰胆碱进行水解，从而维持机体的正常水平。有机磷农药的分子结构中含有亲电子的磷，带部分正电荷，与乙酰胆碱结构相似，因而能竞争性地抑制AChE。AChE分子有阴离子和酯动部位两个活性中心，阴离子活性中心靠静电引力和邻近基团的疏水作用力与乙酰胆碱或有机磷农药结合，以利于酯动部位的进攻。有机磷农药分子结构中亲电子的磷可与AChE酯动部位的丝氨酸羟基发生磷酰化反应，从而使胆碱酯酶丧失活性，失去催化水解乙酰胆碱的能力，造成体内乙酰胆碱大量蓄积，产生中毒。
    不同化学结构的有机磷农药，与乙酰胆碱酯酶的两个活性部位的作用力不同，产生的毒性不同，因而在反复加大剂量染毒期间，缢蛏对不同有机磷农药表现出不同的耐受性。三种有机磷农药的分子结构式如图2所示。其中，敌敌畏为磷酸酯类农药，乐果、马拉硫磷均为硫赶硫逐磷酸酯（或称二硫代磷酸酯）类农药。
      
          乐果                         敌敌畏
  
            马拉硫磷                       马拉氧磷
图2　几种有机磷农药的分子结构式

    有机磷酸酯类农药对AChE的抑制力比硫赶硫逐磷酸酯类农药强。有机磷酸酯的磷氧键上的氧原子较硫赶硫逐磷酸酯类的磷硫键上的硫原子的电负性大，使有机磷酸酯的磷原子带正电性较大，较易与AChE的丝氨酸羟基发生磷酰化反应。硫赶硫逐磷酸酯一般是AChE的弱抑制剂，但当其磷硫键上的硫被氧取代，生成的相应氧类似物则是很强的AChE抑制剂。
    本研究的毒性实验结果表明，作为硫赶硫逐磷酸酯类的马拉硫磷对缢蛏的LC₅₀值却是三种农药中最低的，毒性也最强，缢蛏对其产生的耐受性最小。这是因为，在缢蛏肝脏微粒体混合功能氧化酶（MFO）的作用下，马拉硫磷发生硫代磷酰基氧化脱硫，产生相应的氧类似物 ---- 马拉氧磷。已有实验证明^[3],马拉硫磷在昆虫体内慢慢氧化成抑制酶活性更高的马拉氧磷，增强了其毒性。马拉硫磷对AchE产生50%抑制率的浓度为1×10^－4mol/L，马拉氧磷则为1×10^－7mol/L。但这些氧类似物较易水解，通常不蓄积于生物体内，故在组织中难见^[5]。分析缢蛏体内农药残留时，可检出马拉硫磷，却未发现马拉氧磷。另外，马拉硫磷是在羧酸酯酶作用下水解的，对于软体动物，由于其体内缺少酯酶，因此马拉硫磷对缢蛏具有很高的选择毒性。与马拉硫磷不同的是，缢蛏对乐果的毒性作用不敏感，目前尚未发现有关乐果在软体动物体内转化为氧化乐果的文献报道，因而缢蛏对乐果表现出较大的耐受性。
    有机磷农药分子中若含有吸电子基团或疏水基团，靠静电引力或疏水作用力易与AChE的阴离子部位结合，使有机磷农药分子中亲电子的磷更易与AChE酯动部位的丝氨酸羟基发生磷酰化反应，对生物产生的毒性更强。敌敌畏分子中的两个氯原子是强的吸电子取代基；马拉硫磷分子中酯基的疏水性强，使这两种农药较乐果有更强的与AChE的结合力，表现出更大的毒性。此外，缢蛏对农药的耐受力与农药的物理化学性质也有一定的关系。一般来说，具有较高Kow的有机物亲脂性较强，容易在生物体内富集，易产生较大的毒性效应。三种有机磷农药的Kow值^［6］分别为：马拉硫磷776.25，敌敌畏25.12，乐果0.513。可见马拉硫磷的Kow值比乐果和敌敌畏要高的多，脂溶性强，易被缢蛏吸收富集，体现为养殖水体中较低浓度的马拉硫磷即可产生较强的毒性效应。乐果的Kow值相对最小，说明其水溶性最强，理论上在缢蛏体内不易被富集；而由于缢蛏是滤食性贝类，靠进、出水管进行呼吸、摄食活动，在反复染毒期间，缢蛏对乐果逐渐富集，产生了较强的耐受性，染毒致死后其体内乐果的量最大。敌敌畏的Kow值介于马拉硫磷和乐果之间，缢蛏对敌敌畏的耐受力次于乐果，而高于马拉硫磷。

4 结语
   农药对生物的毒性与农药的分子结构、物理化学性质及生物的代谢等多种因素有关，本研究结果显示，分子中的磷原子带较多正电荷，含较强亲脂基团，Kow值高的农药，对缢蛏的毒性较强。缢蛏经逐步加大剂量的染毒后，对三种有机磷农药的耐受能力为：乐果＞敌敌畏＞马拉硫磷。

REFERENCES
[1] Sun Y G. Guowai yixue weishengxue fence, 2001, 28 (6): 325-329.
[2] Siegelman H W, Guillard R R L: Large Scale Culture of Algae. Newyork, Academic Press, 1971: 110-115.
[3] Zhou Y X, Zhang Z S. Toxicity Test Method of Hydrobiont. Beijing, Agriculture Press, 1989: 112-114.
[4] Chen W Y, Tu Y Q, Qian C F. Pesticides and Application. Beijing, Chemical Industry Press, 1991: 27, 476.
[5] Jiangteng Y Y. Organic Chemistry and Biologic Chemistry of Organophosphorous Pesticides. Beijing, Chemical Industry Press, 1981: 110, 137.
[6] Cai D J. Study of Environmental Toxicology of Pesticides. Beijing, Chinese Environmental Science Press, 1999: 95.