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Sep. 22, 2005 Vol.7 No.9 P.63 Copyright |
(School of Chemistry and Chemical Engineering ,Jinan University, Jinan250022，China) Abstract In this paper, the determination methods of hydroxyl radical in aqueous solutions were summarized. The methods including electron spin resonance (ESR), electrochemical detection (ECD), high performance liquid chromatography (HPLC), chemiluminescent method (CL) , fluorometric method and spectrometric detection were reviewed. The advantages and backdraws of the determination methods were also discussed.
Keywords hydroxyl free radica, determination method, review
水中羟基自由基的测定方法
李桂芳 王西奎 王金刚 国伟林(济南大学 化学化工学院，济南 250022) 2005年7月17日收槁; 国家自然科学基金资助项目(20377019) 摘要 本文综述了水中羟基自由基测定方法及其应用的研究状况，对现有的几种测定羟基自由基的方法如电子自旋捕捉法（ESR）、电化学法（ECD）、高效液相色谱法（HPLC）、化学发光法（CL）、荧光光度法、分光光度法，做了简要的评述，并讨论了这些方法的主要优缺点。
关键词 羟基自由基 测定方法 综述 活性氧自由基（包括超氧阴离子自由基O2－·，超氧自由基O2·，羟基自由基·OH,单线态氧1O2，双氧水H2O2等）是反应活性大、氧化能力很强的自由基，可以使糖类、氨基酸、蛋白质核酸和脂类等发生氧化、遭受损伤与破坏。近10多年来，涌现了大量活性氧特别是羟基自由基和超氧自由基与机体细胞的许多功能活动以及各种疾病，如癌、动脉硬化、糖尿病、心脑血栓、感染以及衰老效应等相关的报道[1-7]。然而，在所有活性氧自由基中·OH被认为是活性最强起主要作用的自由基[8]。人们不仅认识到·OH在生命科学中的重要性，在环境化学中由于·OH是一种非选择性的氧化物，其氧化性仅次于F2，能很容易的氧化几乎所有的有机和无机污染物，氧化效率高，反应速度快，在废水的均相和非均相氧化降解过程中起到主要作用，因此，人们对水中-OH的测定方法也尤为关注。
近年来，在废水和饮用水的深度处理领域·OH的测定得到了较为广泛的研究。由于·OH的寿命短、反应活性高、存在浓度低，因而对于它的测定仍然是一项国际性难题，还没有特别专一有效的方法。根据使用主要仪器的不同，目前常用的方法大体可分为电子自旋捕捉法（ESR）、电化学法（ECD）、高效液相色谱法（HPLC）、荧光光度法、分光光度法等。 1 电子自旋捕捉法（ESR）
电子自旋捕捉法兴起于1945年，它灵敏度高，检测限低，结果可信度高，是目前测定羟基自由基最理想的方法。该法的主要研究对象是含有未成对电子的自由基与过渡金属离子及其化合物，是利用捕集剂与短寿命自由基结合生成相对稳定的自由基，即自旋加合物，用色谱技术对产物进行分离，然后再用ESR测定。然而，自旋加合物的寿命仍然很短，只有几分钟或者十几分钟，因此必须在捕捉后立即进行ESR测定，从而限制了很多实验研究。丛建波等[9]采用液氮（77K）保存羟基的自旋加合物来延长寿命，为ESR检测开辟了新的途径。Y.Abe等[10]利用5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide(DMPO)作捕集剂，ESR法测定了Fenton反应产生的·OH，研究表明 DMPO-OH的猝灭能致使ESR信号减弱， Fe（Ⅱ）离子能使DMPO-OH迅速猝灭，而磷酸盐的加入会提高亚铁离子对DMPO-OH的猝灭速度。K.Y.Chan等[11]以N-叔丁基-a-苯基硝酸灵为捕集剂，研究了ESR法测定Fenton反应产生的·OH过程中影响测定的参数，结果表明，影响ESR测定的参数的重要性次序为Fe（Ⅱ）离子、H2O2、磷酸盐缓冲剂。Zhiru Ma等[12]以a-苯基-N-4-丁基硝酮（PBN）为捕集剂，结合EC技术测定了Fenton反应中产生的·OH自由基，并用ESR法证明了Fenton反应中PBN自旋加合物的存在。刁惠芳等[13]采用电子自旋技术，以PBN 和DMPO为自旋捕捉剂，检测NaCl溶液在电解中和电解结束后的·OH，研究表明加入清除剂D-甘露醇后·OH的ESR信号减弱。
尽管ESR法较为理想，然而此法所用仪器昂贵，测定需要在低温下进行，从而限制了它的广泛使用。另外，必须使用捕集剂如DMPO、PBN等捕集后进行测定，在介质中对羟基有清除作用的杂质也会与捕集剂竞争·OH，影响测定的结果。因此，对所测定体系选择合适的捕捉剂也尤其重要。 2 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法测定自由基，与ESR法相比，仪器较为普遍，一般实验室都能实现。近年许多研究报告利用DMSO捕集羟基自由基，以高效液相色谱法定量测定·OH的产率。Fukui等[14]以DMSO为捕获剂与·OH反应生成甲基亚磺酸（CH3SO2H）和甲基自由基，然后甲基亚磺酸同坚牢黄GC盐(fast yellow GC salts)反应生成重氮化合物，再利用HPLC测定·OH。他们还比较了多种重氮盐如坚牢红TR盐（fast red TR salts）、坚牢红AL盐（fast red AL salts）等，结果发现，坚牢黄与甲基亚磺酸反应产物的信号不但出现尖锐的单峰，而且峰高不受Fe2+等离子的影响。ChaoTai等[15]在研究OH·在水的深度氧化中的作用时，用DMSO捕捉·OH生成甲醛，然后与2，4-二硝基苯肼反应成相应的腙，LC-UV结合间接测定羟基。此法检出限是0.54mmolL-1，已被应用于多种深度氧化过程羟基产量的测定。而P.Leroy等[16]用水杨酸捕捉·OH，生成2，3-二羟基苯甲酸、2，5-二羟基苯甲酸和邻苯二酚，HPLC结合伏安法测定三种产物的总量，间接得到·OH的产率。H.Sakugawa等[17]在研究纯水和天然水在UV-Fenton体系中去除fenitrothion的光催化动力学中，利用HPLC法测定了苯和羟基的加合产物酚。而Kazuhiko T.等[18]采用HPLC通过测定苯和羟基的加合产物酚，间接考查了河水、海水中光致羟基自由基的产率。
HPLC法测定羟基自由基虽然较ESR法容易实现，但其灵敏度、准确度等尚有不足，在分离检测前也需先用捕捉剂捕集自由基,而且反应产物应具有一定的稳定性,方有利于HPLC分离和检测。另外，在环境方面HPLC法多作为一种分离技术与其他方法联用，而其单独作为一种分析检测的方法还有待于进一步完善。 3 化学发光法(CL)
化学发光法是羟基自由基测定中灵敏度最高的方法之一，其原理是化学发光试剂与活性氧自由基反应生成激发态的产物，产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态，放出光子。常用的化学发光试剂有鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素等。其中鲁米诺已被公认为在碱性介质中既可以与·OH自由基反应引起发光，也可以与超氧阴离子自由基或者单线态氧以及H2O2发生化学发光反应。Klara S. 等[19]就是利用鲁米诺发光体系，考查了镁、锰、锌的多种化合物以及维生素C、E等对·OH自由基的产生或消除作用，结果表明鲁米诺化学发光法是一种测定羟基自由基产生和考查金属化合物对·OH自由基是否有清除作用的有效方法。近年来，随着光电检测技术的不断进步，化学发光法已在医学、工业分析等领域里得到广泛的应用，在环境废水处理领域也有较深入的研究。陈秀武等[20]用酵母扩增，化学发光法测定了抗坏血酸-Cu2+-H2O2 体系产生的·OH。徐向荣等[21]在此基础上，用酵母作发光底物,化学发光法测定了Fe2+-H2O2体系产生的·OH，并考查了产生的羟自由基的最佳条件。该方法已经用于模拟染料废水处理中·OH的测定，并同总有机碳（TOC）法作了比较。许申鸿[22]在文献[20,23]研究基础上，改善了体系的组分、操作条件等，采用CuCl- H2O2-邻菲罗啉-碳酸盐缓冲液发光体系，产生并测定羟基自由基，实验表明，该体系更为简便灵敏，适用范围更广，它对于研究·OH的产生及筛选清除·OH的药物具有一定的应用价值。
与电子自旋共振和高效液相色谱两种方法相比,化学发光法操作简便,不需昂贵设备,测定快速；与比色法相比，化学发光法又具有灵敏度高的特点。由于该法还可用于活性氧如H2O2、 1O2、·HO2等的测定，因此它就存在选择性差的缺点，需选择好化学发光体系，以提高选择性、灵敏度。另外，虽然近年来合成的新的化学发光试剂较多，但多用在无机化合物 [24-26]、有机化合物[27-29]等的分析，而专用于羟基自由基的化学发光试剂尚少见。因此，开发简单、经济、高发光率的羟基自由基发光试剂仍是一个重要课题。 4 电化学法(EC)
电化学法测定羟基自由基灵敏度高，检出限低，测定快速、简便，可以用于低剂量·OH的测定。Emrah Kilinc[30]根据以下反应：
Fe(Ⅱ)＋H2O2→Fe(Ⅲ)＋OH＋OH-
4 Fe(Ⅲ)＋3[Fe(Ⅱ) (CN)6]4-→Fe4(Ⅲ)[ Fe (Ⅱ) (CN)6]3
在电化学池中注入Fe(Ⅱ) (CN)6，将Fenton反应后的溶液立即注入化学池，此时Fe(Ⅲ)与Fe(Ⅱ) (CN)6作用生成Fe4(Ⅲ)[ Fe (Ⅱ) (CN)6]3（PB），随着在电极正极上由高自旋的Fe(Ⅲ)转化成低自旋的Fe(Ⅱ)，PB立即转化成无色的埃佛立特盐（K4 Fe4(Ⅱ)[ Fe(Ⅱ) (CN)6]3），通过电化学法测定该盐可以间接测定产生的羟基。Qingjiang W.[31] 、Yuhua Cao等[32]等都曾利用高效毛细电泳技术和电化学结合，通过测定羟基与水杨酸的反应产物2，3-二甲基苯甲酸（2，3-DHBA）、2，5-二甲基苯甲酸（2，5- DHBA）间接测定Fenton反应产生的羟基自由基。马志茹等[33]和Zhiru Ma等[12]则用单扫示波极谱法，在-0.52 V（vs SCE）处的二阶导数阴极波处，检测Fenton或类Fenton反应产生的羟基和PBN的加合产物。而邰超等[34]用Fenton反应产生的·OH氧化DMSO，将生成的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Hantzsch反应，然后用上述方法，在-1.2V(vs SCE)处的二阶导数极谱波处，通过峰电流变化间接测定羟基自由基。该法对于抗氧化剂的筛选具有一定的价值。
电化学法方便、快速，灵敏度高。但电化学法与高效液相色谱法一样，一般多与其他方法连用，如EC-ESR、HPLC-ECD等。随着光电检测技术的蓬勃发展，电化学与其他方法联用例如与ESR、高效液相色谱联用，可能成为未来分析检测·OH的一种可信度高而准确的现代测试技术。 5 荧光光度法
荧光法测定羟基自由基是一种选择性较高，应用较广泛的方法。其原理是利用一种物质捕捉羟基生成羟基加合物，根据反应前后荧光强度的变化间接测定羟基自由基。Chao Tai[35]等用DMSO捕捉·OH生成甲醛，甲醛再与氨和1，3-环己二酮 (CHD)在pH4.5时反应生成有荧光的物质，根据荧光强度的变化测定·OH的量。Ce3+是一种有特征荧光而被氧化成Ce4+后便失去荧光的金属离子，因此很多人都以它为介质研究·OH生成量。刘立明等[36]以Sn2+催化H2O2产生·OH，·OH与Ce3+作用后氧化生成无荧光的Ce4+，通过测定Ce3+荧光强度的变化，结合流动注射技术间接测定产生的·OH。方光荣[37] 、徐向荣[38]也用同样的方法研究了Fenton反应产生的·OH。Boxin O.等[39]以荧光素为探针，用荧光光度法测定了对类Feton体系Co(Ⅱ)- H2O2产生的·OH自由基的抑制作用。C.V.Sonntag等[40]超声辐射N2O饱和的水溶液产生·OH，·OH进攻对苯二酸盐（TA）生成具有特征荧光的羟基化产物，荧光光度法间接测定·OH。Matt King等[41]采用香豆素-3-羧酸（CCA）和amine-functionalized polyacyrylamide(AFPA)形成的共价化合物为探针，荧光光度法测定CCA与羟基自由基的强荧光产物，间接测定紫外辐射双氧水和Fenton体系两种方法产生的·OH自由基。
研究证明，荧光光度法选择性高，较分光光度法具有较高的灵敏度，在特定的波长下不易受其他离子的影响。尽管此法的准确度和灵敏度较ESR法稍逊一筹，然而荧光光度法操作简便，易于实现，是目前采用较多的方法。 荧光光度法缺点是须羟基的加合产物具有特征荧光，或者捕捉剂本身具有特征荧光。 6 分光光度法
分光光度法的基本原理是通过反应溶液颜色的变化间接测定羟基的量。而据反应液中显色物质的不同又可分为两类：比色法和氧化显色剂法。
比色法：Steiner等[42]用DMSO捕获OH·形成甲基亚磺酸,在430nm比色测定Fenton反应、水的γ射线辐解、H2O2的紫外光解三个体系产生的·OH。徐向荣等[43]用同样的捕捉剂与·OH反应生成甲基亚磺酸，再与坚牢蓝BB反应生成偶氮砜，紫外可见分光光度法间接测定Fenton反应中OH·的生成量。实验还测定了核桃、黑芝麻等几种天然食物的水提取物清除羟自由基的功能。贾之慎等[44]则用水杨酸捕捉·OH，分光光度法间接测定Fenton反应产生的·OH。该法可作为一种简便的筛选羟基自由基清除剂的方法。
氧化显色剂法：吴南等[45]用羟自由基与溴邻苯三酚红（BPR）发生氧化反应，根据BPR颜色变化，用紫外-分光光度计测定ΔA560值的变化，以测定Fenton反应中OH·的生成量。实验结果表明ΔA560与、FeSO4及H2O2呈量效关系。同时发现甘露醇、苯甲酸与清除羟自由基作用呈明显的量效关系。他[46-47]还基于上述原理还提出了Co2+、H2O2、BPR和Cu2+、H2O2、BPR两个类Fenton分析新体系，并将其用于羟自由基的测定。刘德启等[48]利用混合稀土与微量H2O2催化氧化二苯基碳酰肼，三氯甲烷萃取氧化产物，分光光度法间接测定H2O2中的羟基自由基。金鸣等[49]将邻二氮菲的无水乙醇溶液用水稀释，磷酸盐调节pH7.4，加入 Fenton试剂，据反应液颜色变化，间接测定此体系中的·OH，此方法还可通过氧化还原指示剂邻二氮菲-Fe2+的颜色变化，用于反映溶液氧化还原状态的改变。总之，国内利用分光光度法测定Fenton体系产生羟基自由基的研究很多[50-52]，只是显色体系不同而已。
分光光度法仪器简单，操作简便快速，因此应用广泛，可以作为筛选羟自由基清除剂的简单方法。但此法灵敏度较低，检出限高，适用于较高浓度羟基自由基的测定，而对于低剂量的测定可信度较低。 7 结束语
羟基自由基在生命科学和环境科学中都扮演着重要角色。研究开发选择性好、灵敏度高的羟基测定方法，对于解释生命机体的各种生理、病状，研究污水、饮用水的深度处理都具有重要的意义。但是目前报道的测定方法均是测定羟基加合物或者加合物再与一种物质反应生成的更稳定的新物质来间接测定羟基。这样就存在许多需要解决的问题，如在不同体系捕捉羟基的最佳条件是什么，羟基化反应是否完全，生成物质是否稳定，如何去除介质中的羟基清除物质等问题。因此，对于现有方法的选择性、准确度还有待于进一步提高。 REFERENCES
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