Determination of organic acids in tobacco by high-performance liquid chromatography based on matrix solid phase dispersion

基质固相分散样品处理-高效液相色谱法测定烟草中的有机酸

摘要 研究了用基质固相分散高效液相色谱法测定烟草中有机酸的方法；将烟草样品与石墨化碳黑球 (W/W,1:4) 充分研磨后装柱，用热水洗脱，洗脱液中的有机酸用高效液相色谱测定；以ZORBAX Stable Bound (4.6 ´ 50 mm, 1.8 mm)快速分离柱为固定相，0.01 mol/L NaH₂PO₄(pH 2.98)和乙腈(体积比为98:2)为流动相，流速为2.0 mL/min，柱温25℃，检测波长210 nm。方法回收率为94%-98%；相对标准偏差为2.1%-3.0%；检测限在80-200 m g/L之间。色谱分离时间不超过3.0 min，结果令人满意。
关键词 高效液相色谱法；有机酸；烟草；质固相分散

1 引言
    有机酸是烟草中的重要组成成分^[1-3]，传统的分离和测定烟草有机酸的方法是气相色谱法^[3,4]，但采用这些方法分析非挥发性有机酸时必须先进行衍生化，从而会影响分析的过程和结果。离子色谱法(IC)和高效液相色谱法 (HPLC)是近年来测定有机酸采用比较多的方法^[5-6]，但是样品处理较为复杂。基质固相分散是一种新样品处理技术，它浓缩了传统样品均化，组织细胞裂解，提取，过滤，净化等过程，使样品的预处理变得简便，同时也避免了目标物的损失。由于该方法的简便、样品和溶剂用量少等优点，已被广泛应用于蔬菜、水果和植物中农药、杀虫剂等残留的分析 ^[7-9]。但用于烟草中有机酸的测定还未见报道过。本文研究了采用基质固相分散法提取净化，高效液相色谱法测定烟草中有机酸的方法，取得满意结果。

2 实验部分
2.1 主要仪器与试剂
    1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；包括 1100 四元泵，1100紫外二极管阵列检测器，Chemical Station 色谱工作站；CAL204电子天平(感量0.0001 g，梅特勒-托利多仪器公司)；UV-160 A 紫外可见光分光光度计(日本岛津公司)；Beckman F-200 酸度计(美国Beckman公司)。乙腈(色谱纯，美国Fisher公司；磷酸、磷酸二氢钠 (优级纯，天津化学试剂厂)；乳酸、草酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸标准品(纯度³ 99%，购于瑞士Fluka公司)；其它试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
2.2 色谱条件
   色谱柱为ZORBAX Stable Bound (4.6 ´ 50 mm, 1.8 mm) 快速分离柱；流动相为0.01 mol/L NaH₂PO₄(pH 2.98)和乙腈(体积比为98:2)；流速 2.0 mL/min；柱温：25℃；进样量5 mL。此条件下，6种有机酸能得到有效的分离，标样和样品的色谱图见图1所示。

图1 标样(a)及实际样品(b)色谱图
(1) 草酸，(2) 苹果酸，(3) 乳酸，(4) 乙酸，(5) 柠檬酸， (6) 琥珀酸

3 结果与讨论
3.1 色谱条件的选择
    参照文献^[6]，6种酸在210 nm都有较强的吸收，故确定检测波长为210 nm。用0.01 mol/L NaH₂PO₄(pH 2.98)和乙腈(体积比为98:2)，这6种有机酸的分离都比较合适，因此实验选择该流动相。
    用普通色谱柱分离有机酸分析时间长，要10 min 以上，为了能显著的缩短分离时间，我们研究了用ZORBAX Stable Bound (4.6 ´ 50 mm, 1.8 mm)快速分离柱分离有机酸的方法，结果表明，6种有机酸在3.0 min内可达到完全分离。柱温对有机酸的分离没有显著影响，选择室温。
3.2 样品处理条件
    在基质固相分散中，固相分散剂同时起着支持剂、吸附剂和净化剂的作用，它的选择非常重要。石墨化碳黑球属于反相材料，对小极性物质有较强的吸附，而大极性物质吸附弱，研磨时样品中的各种组分根据极性的不同吸附在石墨化碳黑球上。根据相似相容原理，在提取烟草中的有机酸时，烟草中还含有其它成分，如蛋白质，脂肪、萜类物质、多酚等干扰成分。当烟草样品和反相石墨化碳黑球研磨后，蛋白质，脂肪、萜类物质、多酚等非极性的干扰组分吸附在非极性的石墨球上，用热水洗脱时，有机酸极性很大，在反相柱上不保留，被洗脱剂洗下，而与反相石墨球结合强的蛋白质，脂肪、萜类物质、多酚等干扰成分保留在石墨球上，因此反相石墨球能好的起到提取净化效果，本实验选择它为分散剂。
    为了能让有机酸充分洗下而干扰物尽可能多的保留在石墨化碳黑球上，达到制备样品并有效分离干扰物的目的，实验选用水为洗脱剂，而烟草中的有机酸有的以结合态存在，需用酸洗脱使结合态的有机酸置换出，因此实验选择先用0.1 mol/L的磷酸洗脱再用水洗脱的方法，实验表明洗脱效率随温度的增加而增加，以 5 mL/min的流速，常温下需要20 mL 0.1 mol/L的磷酸，30 mL的水才能让有机酸完全洗下，但是在80 ℃以上， 4 mL 0.1 mol/L的磷酸 和5 mL的水就能把样品中的有机酸完全洗下(合并残渣回流提取后没有有机酸检出)，因此实验选择装好柱后以5 mL/min的流速用4 mL 0.1 mol/L的磷酸(>80℃)洗脱，再用6 mL的热水(>80℃)洗脱的方法。
3.3回收率实验及精密度
    精密度实验样品每样平行测定5次 (每次测定称取相同样品两份，其中一份加入已知量有机酸标样，另一份不加)，按5次平行测定的结果计算相对标准偏差。通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量测出量计算回收率，结果见表1。表1数据表明，该方法具有较高的回收率和较好的精密度。

表1 方法精密度及回收率

3.4 回归方程、相关系数及检测限
    分别配制浓度为500 mg/mL，100 mg/mL，20 mg/mL，4 mg/mL，0.8mg/mL的有机酸混合标准溶液，进样后计算出不同浓度的峰面积，计算出回归方程，结果见表2。

表2 工作曲线及检测限

3.5样品分析及结果
    样品按2.3实验方法处理，并按选定色谱条件测定，结果见表-3。

表3 卷烟样品分析结果

4 结 论
    本方法以ZORBAX Stable Bound (4.6 ´ 50 mm, 1.8 mm)快速分离柱为固定相，0.01 mol/L NaH₂PO4 ₍pH2.98)和乙腈为流分离烟草中的有机酸，6种有机酸在3.0 min 内可达到完全分离，是目前液相色谱测定烟草中有机酸分离时间最短的方法之一。且在样品前处理中采用了基质固相分散技术，样品前处理步骤非常简单，不需要特殊的仪器设备，成本低。总之，该方法准确可靠，重现性好，回收率满意，检测限较低，可用于烟草中有机酸含量的质量分析与控制，具有实用价值。