Abstract A synchronous scanning-dual wavelength fluorimetric method for simultaneous determination of epinephrine, norepinephrine and dopamine has been described. The ramifications of E、NE and DA have been respectively scanned simultaneously to examine the factors which affect the intensity of systematic fluorescence. When Dl was 70 nm, the largest fluorescence signal of DA, which was 385 nm, was not disturbed in the simultaneous fluorescence spectrum gained and the mutual interference of E and NE could be eliminated by the dual-wavelength method. The largest fluorescence intensity could be got in 0.5 mol·L^-1 acetic acid-sodium acetate buffer at pH 6.5 and the heating time of E, NE and DA were 1 min, 3 min and 35 min respectively. The linear ranges were 1-320 ng·mL^-1 (r = 0.9995) for epinephrine, 3-640 ng·mL^-1 (r = 0.9998) for norepinephrine and 1-160 ng·mL^-1 (r = 0.9993) for dopamine. The detection limits of E, NE and DA were 0.20 ng·mL^-1, 0.97 ng·mL^-1 and 0.73 ng·mL^-1 respectively. Satisfactory results were obtained by the proposed method for determination of trace amounts of neurotransmitters in several synthetic samples.
Keywords Synchronous scanning-dual wavelength fluorimetry, Catecholamines, Determination

赵燕燕¹，苏芳²，王翠玲²，姜明明²，白洁¹
（¹河北大学医学实验中心，河北 保定 071000；²河北大学药学院，河北 保定 071002）

2007年6月5日收稿;河北省科技攻关资助项目（05276101D-88，42761220）；河北省中医药管理局资助项目（批准号：05015）；河北大学人才引进项目（批准号：y2004039）和河北大学自然科学基金项目(2005408)资助

摘要 建立一种同步荧光法与双波长法结合起来同时测定肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）三种神经递质的方法。对E、NE和DA三种神经递质的衍生物分别进行同步扫描，考察影响体系荧光强度的因素。Dl = 70 nm时获得的同步荧光光谱图中，DA在385.0 nm处的荧光信号不受干扰，而且E和NE的相互干扰可通过双波长法消除。最佳实验条件为：0.5 mol·L^－1乙酸－乙酸钠缓冲液（pH 6.5），E、NE和DA的加热时间分别为1 min、3 min和35 min。E、NE和DA线性范围分别为1～320 ng·mL^-1、3～640 ng·mL^－1和1～160 ng·mL^-1，相关系数分别为0.9995、0.9998和0.9993；检测限分别为0.20 ng·mL^-1、0.97 ng·mL^-1和0.73 ng·mL^-1 。该法用于儿茶酚胺类神经递质的测定，结果令人满意。
关键词 同步荧光法 双波长法 儿茶酚胺类神经递质 测定

    儿茶酚胺类神经递质（catecholamines, CAs）包括肾上腺素（epinephrine, E）、去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）和多巴胺（dopamine, DA）。CAs的含量与疾病的发生密切相关。因此建立一套灵敏度高，选择性好的检测分析方法对于临床疾病发病机理的探讨和治疗方案的确定具有非常重要的意义。
    目前对儿茶酚胺类神经递质的检测方法主要有高效液相色谱法^[1-4]、电化学法^[5-7]、毛细管电泳法^[8-10]等，前两种方法样品预处理方法复杂，后一种方法检测灵敏度不高，对实际生物样品的检测有一定的局限性。传统荧光分析法主要分为三羟基吲哚法和乙二胺缩合法^[11]。前者衍生产物不稳定，所需步骤繁琐，影响其在实际检测中的应用；后者对E和NE的选择性不高，不能实现对两者的分离检测。本实验利用同步荧光法的简化光谱、减少光谱重叠和谱带窄的优点，将同步荧光法引入儿茶酚胺类神经递质的测定中，选用合适的波长差进行同步扫描，获得了有较好分离的荧光光谱，运用双波长法对光谱进行处理，取得了良好的结果。
    同步荧光法已广泛用于药物分析和蛋白质、氨基酸^[12-14] 等领域的测定中，但与双波长法结合起来用于样品测定的文章尚未见文献报道。此方法对于其他荧光光谱有一定重叠的物质的检测具一定的借鉴意义。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂    
    RF-5301PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）；pHS－3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）；超纯化水机（重庆颐洋企业发展有限公司）。
    肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺标准品均购于Sigma公司。其他试剂均为分析纯，水为二次去离子水。0.05 mol·L^-1的碘溶液：称取1.27 g碘于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容。
   碱性亚硫酸钠溶液：临用时用5 mol·L^-1的NaOH与25%的Na₂SO₃溶液按9:1比例混合配制。
1.2 实验方法
    在1、2、3号三只25 mL具塞比色管中分别加入2.0 mL含有E、NE和DA的三种组分的混合溶液，在各管中分别依次加入3.5 mL乙酸－乙酸钠缓冲溶液，1.0 mL 0.01 mol?L^-1 EDTA溶液，0.5 mL碘溶液，摇匀，放置2 min，加入1.0 mL碱性亚硫酸钠溶液，摇匀，放置2 min，最后加入1.0 mL 5 mol·L^-1醋酸溶液，3号管中另加入1.0 mL 45 %的磷酸溶液。将试管放在90 ℃水浴中加热，1号管加热1 min，2号管3 min，3号管35 min。然后迅速取出，放入冷水中冷却至15 ℃，加水定容至10 mL。分别用于测定E、NE和DA衍生物的荧光强度、和。取E、NE单组分标准品各2份，于比色管中，分别按照以上条件处理，其中一份加热1 min，另一份加热3 min，用于与混合样品对照。
   在发射波长l_em 370 nm～550 nm范围内，激发波长l_ex和发射波长l_em的波长差为70 nm（Dl = 70 nm）处分别扫描样品，获得同步荧光谱图。对于E和NE的分离测定，采用双波长法进行分析，分别从图谱中读出两个l_em（500.0 nm、445.6 nm和470.0 nm、531.8 nm）下的荧光强度。
1.3 线性范围和检测限
   配制一系列不同浓度的标准溶液，在已建立的实验条件下进行测定。以荧光强度（F）对标准溶液的浓度（C）作图，得到三种物质的标准曲线。根据IUPAC（3d）的规定，由公式：D = 3 × d / k（k为工作曲线斜率，d为11份空白溶液荧光强度标准差），求得检测限。结果见表1。

表1 线性关系和检测限

1.4 稳定性试验
    将测试样品15 ℃恒温避光保存，每隔5 min进行一次荧光测定。E、NE和DA荧光产物分别在150 min、220 min和90 min内保持稳定，其荧光强度无明显变化，说明衍生产物稳定性良好。

2 结果与讨论
2.1 同步荧光光谱波长差（Dl）及双波长的选择
2.1.1 波长差（Dl）的选择   
    同步荧光光谱通常指固定波长同步荧光光谱，是使发射波长和激发波长之间保持固定的波长间隔Dl（Dl = l_em － l_ex），同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号（F）与对应的发射波长（l_em）或激发波长（l_ex）作图得到的光谱图。Dl的选择是同步荧光分析中的关键，它关系到光谱峰的强度、形状和峰之间的“错位”程度，也即关系到检测的灵敏度和选择性。
    在l_ex = 300 nm，Dl = 10～100 nm范围内每隔10 nm对E、NE和DA单组分标准液分别进行同步荧光扫描，结果发现，随着Dl的增大，光谱强度逐渐增大，峰宽减小，当Dl = 70 nm时，获得的荧光光谱峰形较好，荧光强度达到最大，半峰宽度最小，三种物质的“错位”程度最大。Dl > 70 nm时，峰宽增大，峰高降低，三物质的“错位”程度降低，因此，选择Dl = 70 nm作为固定波长差。在此波长差下，DA在最大荧光信号处（385 nm）不受E和NE的干扰，E和NE的相互干扰可通过双波长法消除。
2.1.2 双波长的选择        
    同步荧光光谱与双波长法结合起来，可以有效的提高选择性，解决互相干扰的多组分在分析检测中的问题。
    用于测定NE含量的制备样品的荧光光谱见图1，其中Mixture为E、NE和DA的混合样品的同步荧光光谱，E、NE和DA为与混合样品各组分浓度相同的单体的同步荧光光谱，反应时间都为3 min（如果测定E，则反应时间为1min）。对于含有E、NE和DA的三组分体系，DA与E和NE之间互不干扰，可实现单独测定，E和NE的分离测定可利用双波长法。先把NE看成分析物，E看作干扰物。扫描E和NE的同步荧光光谱，NE在其最大荧光信号（470.0 nm）处，浓度与荧光强度呈线性关系，作为选定波长1；E在波长470.0 nm和531.8 nm处的荧光强度相等，相等关系不随浓度的改变而改变，将531.8 nm作为选定波长2。根据荧光分析理论，荧光具有加和性。在波长470.0 nm和531.8 nm处的荧光强度F有如下关系：
(1)
(2)
而且，将(1)－(2)得：
（3）
    根据实验结果，NE在531.8 nm处的荧光强度为固定值，不随浓度的改变而变化（见图2），则E对NE的干扰即可消除，由（3）式可求得NE在470 nm处的有效荧光强度。
    同理，把E看作分析物，NE看作干扰物，可得到，为固定值（见图3），求得E在500 nm处的有效荧光强度。

图1 E、NE、DA单体和混合物同步荧光光谱图
E、NE、DA为单组分，Mixture为E、NE、DA的混合物
实验条件：反应时间为3 min；Dl = 70 nm；通带宽度：5 nm，5 nm

2.2 影响峰形因素的考察
2.2.1 单体标准品浓度对峰形的影响         
    配置不同浓度的E（30～240 ng·mL^－1）和NE（150～630 ng·mL^-1）单体标准溶液，在实验条件下进行同步荧光光谱扫描，结果见图2和图3。结果表明，随着浓度的增加，峰高增加，且二者呈线性关系，但峰形（峰宽和对称性）不变。即浓度改变不影响方法的测定结果。

图2 不同浓度的E的峰形

图3 不同浓度的NE的峰形

2.2.2 加热时间对峰形的影响
    实验考察了单体标准品加热时间对峰形的影响，结果表明，加热时间的变化对峰形（峰宽和对称性）没有影响。
2.3 影响体系荧光强度因素的考察
2.3.1 通带宽度对荧光强度的影响  
    配制40.00 ng·mL^－1的E、NE和DA标准液，按“1.2”项下的方法进行衍生化，衍生产物在不同的Ex和Em通带宽度条件下扫描同步荧光光谱。随着宽度的增加，荧光强度随之增强，但背景干扰也在增加，为了兼顾灵敏度和背景干扰，我们选用Ex、Em通带宽度均为5 nm。
2.3.2 缓冲体系对荧光强度的影响       
    按照已建立的方法，考察了硼酸－硼砂、碳酸钠－碳酸氢钠、磷酸氢二钠－磷酸二氢钠、Tris－盐酸、乙酸－乙酸钠五种缓冲溶液对体系荧光强度的影响，结果表明使用乙酸－乙酸钠缓冲溶液时体系荧光强度最大，而且背景干扰较小，因此本试验采用乙酸－乙酸钠作为缓冲溶液。
    同时考察了乙酸－乙酸钠缓冲溶液的pH值和浓度对体系荧光强度的影响，pH值的影响见图2，浓度的影响见图3。由图2可以看出，三种神经递质在pH值6.0～7.0时具有最大荧光强度，本实验选择pH值为6.50。由图3看出，当浓度为0.5 mol·L^-1时，E、NE和DA的荧光强度都达到最大值，因此本实验采用缓冲液的浓度为0.5 mol·L^-1。

图4 缓冲溶液pH值的影响
实验条件：缓冲溶液1 mol·L^-1
通带宽度：5 nm，5 nm

图5 缓冲溶液浓度的影响
实验条件：缓冲溶液pH 6.5
通带宽度：5 nm，5 nm

2.3.3 加热时间对荧光强度的影响
    儿茶酚胺类神经递质在90 ℃水浴中发生衍生化反应。加热时间对体系荧光强度的影响见图4。由图可以看出，E和NE分别在加热1 min和3 min时，荧光强度达到最大，随着时间的延长，荧光强度逐渐减弱。DA在加热35 min时荧光强度达到最强，并且强度保持不变。为了使E、NE和DA的衍生率达到最大，产生最大荧光强度，提高检测灵敏度，本实验把样品分成三份，分别用于测定E、NE和DA。三支管的加热时间分别为1 min、3 min和35 min。

图6 加热时间的影响
实验条件：缓冲溶液0.5 mol·L^-1，pH 6.5
通带宽度：5 nm，5 nm

2.4 样品测定
    利用已建立的实验条件对含有不同浓度的E、NE和DA的混合样品进行测定，结果见表2。结果表明，测定结果不受混合样品中E、NE和DA含量比例的影响。

表2 样品测定结果（n = 5）

3 结论
    首次将同步荧光法与双波长法结合起来应用于样品的检测中，获得了良好的结果。尤其适用于荧光光谱有一定干扰的物质的分析检测。
    此法用于三种儿茶酚胺类神经递质的同时检测，精确度和准确度都较高，方法操作简单，检测限低，对于基础研究和临床检测有一定的应用价值。

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