A weak ion monolithic column for on-line SPE and analysis of cefazolin sodium in human plasma

Abstract A weak ion exchange monolithic column prepared by modifying the GMA-MAA-EDMA (glycidyl methacrylate - methacrylic acid - ethylene glycol dimethacrylate) monoliths with ethylenediamine was applied to remove matrix compounds in biological fluid that otherwise would interfere with the analysis. Water could be used as the washing liquid to flush out matrix compounds while retaining negative charged small molecules. Using this monolithic column, on-line SPE and screening of cefazolin sodium in human plasma samples had been investigated. Chromatography was performed by reversed-phase HPLC on a C₁₈ column with ultraviolet detection at 254 nm. The mobile phase was an aqueous solution containing 9.4 mmol·L^-1 Na₂HPO₄ and 5.3 mmol·L^-1 citric acid with acetonitrile (87:13, V/V) and the flow rate was set at 1.0 mL·min^-1. The method, which was validated with good recovery, precision and linearity, avoided tedious pretreatment and provided a fast, economic and effective method for assaying trace drugs in plasma samples.
Keywords Weak ion exchange monolithic column; On-line SPE; Cefazolin sodium; Plasma

弱离子整体柱在线固相萃取及分析人血浆中头孢唑啉钠

朱涛¹，杨更亮^1,2，曹伟敏¹，赵玉¹，李风新¹
（¹河北大学药学院 保定 071002；²中国科学院化学研究所分子科学中心 北京 100080）

摘要 以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸（MAA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，在不锈钢柱管中聚合反应，然后用乙二胺在线修饰为弱离子交换整体柱。将其作为在线固相萃取材料，在水下即可去除人血浆中的大分子干扰物质，同时对带负电荷的小分子药物有富集作用，本文用该离子柱在线预处理同时测定人血浆中头孢唑啉钠。分析流动相为9.4 mmol·L^-1 Na₂HPO₄ 和5.3 mmol·L^-1 柠檬酸-乙腈（体积比87:13），流速为1.0 mL·min^-1, 在254 nm处进行检测。实验结果表明，该方法具有良好的线性，回收率及精密度,避免了繁琐的样品预处理过程，为血浆中痕量药物的分析提供了一种快速、经济和有效的新方法。
关键词 弱离子交换整体柱；在线固相萃取；头孢唑啉钠；血浆

1 实验部分
1.1 试剂与仪器   
    主要仪器：PU-1586高效液相色谱仪（日本，JASCO公司）；UV-1570紫外可变波长检测器（日本，JASCO公司）；不锈钢空色谱柱管（10 mm × 4.6 mm i.d.）；HW-2000色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；ODS C₁₈柱（Diamonsil^TM，250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；HH-601 超级恒温水浴（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。
    主要试剂：头孢唑啉钠冻干粉(中诺药业（石家庄）有限公司)；Na₂HPO₄（北京益利精细化学品有限公司）；柠檬酸（河北省保定市化学试剂厂）；乙腈，四氢呋喃，环己醇，正十二醇（天津北联精细化学品开发有限公司）；乙二胺（天津市天大化工实验厂）；甲基丙烯酸（MAA天津市化学试剂一厂）；偶氮二异丁腈（AIBN，上海试剂四赫维化工有限公司）；甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，苏州安利化工厂)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，美国Acros 公司)；以上液体试剂进入色谱系统前均经过0.45 μm微孔滤膜过滤。健康人血浆由河北大学医院提供。
1.2 弱离子交换整体柱制备   
    在干燥的不锈钢空柱管中加入一定比例的经超声及氮气除氧的GMA、MAA、EDMA、AIBN、正十二醇和环己醇的混合溶液，抽真空20 min后密封，在55 ℃恒温条件下反应24小时，用甲醇冲去致孔剂及未反应可溶性物质后，将乙二胺-四氢呋喃混合溶液（1：1，V/V）在60 ℃恒温条件下以0.1 mL·min^-1 通过色谱柱，反应24小时后用甲醇冲去未反应的乙二胺，至色谱柱流出液不显碱性。反应过程见图1。

图1 弱离子交换整体柱的制备过程
Fig.1 The preparation of the ion exchange monolithic column

1.3 样品制备       
    准确配置1000 mg·L^-1头孢唑啉钠水溶液作为标准储备液，将标准储备液分别用水稀释成浓度为100 mg·L^-1和10 mg·L^-1的中间储备液，用于配置线性范围在1.0 mg·L^-1- 100 mg·L^-1的血浆样品, 血样质量控制样品浓度为1.0 mg·L^-1, 10 mg·L^-1 和30 mg·L^-1，均为临用前配置并于4 ℃冷藏保存。
1.4 色谱条件
    弱阴离子交换整体柱(10 × 4.6 mm i.d.)；分析柱为ODS C₁₈柱；流动相为9.4 mmol·L^-1 Na₂HPO₄ 和5.3 mmol·L^-1 柠檬酸 - 乙腈（体积比87:13)，流速为1.0 mL·min ^-1, 在紫外检测波长254 nm处进行检测。
1.5 样品预处理方法与色谱分析
    将预处理柱(弱阳离子交换整体柱)置六通进样阀定量环处，当处在“Load”位置时，首先推入2.0 mL过滤三蒸水，然后将50 μL待测样品直接上样，再用3.0 mL 过滤三蒸水淋洗，最后将六通进样阀扳至“Injection”位置，进入C₁₈分析柱进行定量分析。

2 结果与讨论
2.1 实验条件的优化
2.1.1 MAA/(GMA+MAA)的单体比例对弱离子交换整体柱性能的影响
    头孢唑啉钠（Pka，2.5）和血液中大分子如白蛋白（PI，4.9），与预处理柱上的羧基和氨基两种基团间均有静电引力和排斥作用，两种静电力间的竞争决定药物和大分子在预处理柱上的保留情况。MAA/(GMA+MAA)的单体比是决定离子柱性能优劣的关键因素，其它条件不变，单体比分别为0, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 实验结果表明单体比为20%时，离子柱才能达到水下保留药物同时去除大分子的效果。
2.1.2 弱离子整体柱预处理能力的考察
    血浆中的蛋白种类较多且含量高，为考察预处理柱能否较好的去除血浆中的内源性干扰物质，分别进50 μL空白血浆样品和头孢唑啉钠水溶液于空管和弱离子柱，水为流动相，流速为1.0 mL·min ^-1，检测波长分别为280 nm和254 nm。由于头孢唑啉钠可以与预处理柱上的氨基产生较强的静电吸引作用，在整体柱上有一定的保留，而蛋白等内源性物质在预处理柱上没保留，因此，在3 min时，蛋白等内源性物质能被较好的洗脱下来，而头孢唑啉钠在整体柱上有较好的保留。实验结果表明，用3.0 mL水作为洗脱淋洗液，即可完成对血样的预处理。由于血浆中的药物浓度较低，所以先通过预处理柱对药物富集后再进行分析，本文的富集进样体积为50 μL，实验结果表明，此进样体积可以满足血浆中头孢唑啉钠的测定要求。
2.1.3 样品预处理过程的分析     
    本实验利用液相色谱仪上六通进样阀实现柱切换过程，进行血浆样品的预处理。首先将预处理柱置六通进样阀定量环处，当处在“Load”位置时，推入2.0 mL 过滤三蒸水，目的是去除预处理柱和连接管中的甲醇等有机溶剂，防止蛋白变性；然后将50 μL待测样品直接上样，样品从预处理柱的尾端进入，用3.0 mL过滤三蒸水淋洗，洗脱下来的蛋白由柱子顶端流出，而药物则富集在预处理柱的尾端，从而实现去除蛋白等生物内源性干扰物质和富集药物的目的；当处在“Injection”位置时，分析流动相将保留在预处理柱上的药物反向洗脱后进入C₁₈分析柱进行定量分析。由于药物被富集在预处理柱的尾端，分析流动相是反向洗脱的，此时可以认为药物能够在很短的时间内从预处理柱中洗脱下来，这样可以有效避免传统非反向洗脱而导致药物在预处理柱中洗脱缓慢而产生的色谱峰展宽、拖尾等不良现象，改善色谱峰形。
2.1.4 血液样品的色谱分离图     
    图2为空白血浆和1.0 mg·L^-1头孢唑啉钠血样的色谱图。头孢唑啉钠的保留时间为15.9 min，由空白血样对照可知在药物出峰处无干扰，能与前面系统峰分离开，峰形良好。说明该方法分离效果好，专属性好。

图2 空白血样(A)和头孢唑啉钠血样(B)的色谱图
Fig 2 The chromatograms obtained from blank plasma sample and plasma sample spiked with cefazolin sodium (A) blank plasma; (B) plasma sample spiked with cefazolin sodium

2.2 方法学的考察
2.2.1 标准曲线及检出限           
    精密量取头孢唑啉钠标准溶液，用血浆将其依次稀释成浓度为1.0 mg·L^-1，5.0 mg·L^-1，10.0 mg·L^-1，30.0 mg·L^-1，50.0 mg·L^-1，80.0 mg·L^-1，100.0 mg·L^-1系列浓度溶液，按 "1.5"项下操作，每个浓度的样品进样三次。以药物浓度 (C, mg·L^-1) 对色谱峰面积（A）进行线性回归，得到头孢唑啉钠血样的线性方程，回归方程为：A ＝2.11 × 10⁴ C – 4.88 × 10³，r = 0.9992 (n = 7)。表明头孢唑啉钠血样在1.0 mg·L^-1 -100.0 mg·L^-1浓度范围内线性关系良好，当信噪比为3时，测得头孢唑啉钠的检出限为0.3 mg·L^-1。

2.2.2 精密度及回收率试验  
    准确配制头孢唑啉钠1.0 mg·L^-1, 10 mg·L^-1, 30 mg·L^-1低中高3种质量浓度的血样和同样浓度的对照品溶液各5份，将对照品溶液直接注入C₁₈柱进行分析，而血样按“1.5”项下操作,每一浓度平行操作进样5 份,代入线性方程计算方法的准确度。以血样测得值与对照品直接在C₁₈柱上测得值的比值计算绝对回收率，并计算日内、日间精密度,结果方法回收率在95.0% - 105.0%之间，日内、日间RSD 均小于5.0% ,精密度高，重现性良好，结果见表1。

表1 头孢唑啉钠三种不同质量浓度的血液样品精密度及回收率
Table 1 The precision and recovery of cefazolin sodium determination in human plasma samples spiked with three different concentrations

3 结论
　　　 本文研制了一种新型用于在线固相萃取预处理的整体柱，采用该离子柱在线预处理同时测定人血浆中头孢唑啉钠，方法避免了繁琐的样品预处理过程，为血浆中痕量药物的分析提供了一种快速、经济和有效的新方法。

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