Binding and cleavage study of a novel calixarene derivative with DNA

Shi Huijie, Shi Xianfa
(Chemistry Department of Tongji University, Shanghai 200092, China)

Abstract In this paper, the binding properties of a novel calix[4]arene derivative containing uracil, 5-(Uracil-N¹-acetamido)-25, 26, 27, 28-tetrahydroxycalix[4]arene (UC), with CT-DNA was investigated by UV-Vis spectroscopy and viscosity measurements. The results showed that UC can recognize DNA and bind DNA via an intercalative mode, and a kind of supramolecular complex was formed where UC: DNA=1:1. Moreover, the cleavage of pBR322 DNA was studied by agarose gel electrophoresis. It indicated that UC can catalyze the cleavage of pBR322 DNA by H₂O₂ at 37^oC, and pBR322 DNA was transformed from Form I (supercoil form) to Form II (open circular form). These results provide the theoretical and practical basis in the development of enzyme mimic regent containing calixarene for the site-specific cleavage of DNA.
Keywords enzyme mimic, calixarene, cleavage of DNA, molecular recognition


新型杯芳烃衍生物与DNA作用性质的研究

史慧杰，施宪法
(同济大学化学系 上海 200092)

摘要 本文采用紫外滴定和粘度测试的方法研究了新型杯芳烃衍生物UC与CT-DNA的相互作用，结果发现：UC可以以经典插入的模式与DNA作用，并与DNA形成1：1的超分子化合物；我们推测可能是UC中的碱基尿嘧啶插入到了DNA的碱基对中间，起到了识别DNA的作用。同时，我们采用琼脂糖凝胶电泳的方法，研究了pBR322 DNA的断裂情况，结果发现：在温度37^oC条件下，UC的存在对H₂O₂断裂pBR322 DNA起到了超分子催化的作用，使DNA从闭环超螺旋的Form I 型转变为缺刻的Form II型。
关键词  模拟酶，杯芳烃，DNA断裂，分子识别

1 概要
    核酸断裂与基因重组技术是分子生物学和基因工程学的核心技术，其中对DNA和RNA的定位切割又是该技术的关键。人们试图通过化学的方法合成能够定点切割DNA的分子剪刀或者酶的模型物，通过DNA的定点切割或者氧化断裂，水解断裂等，寻找储存在DNA分子中的遗传信息，了解生命的奥秘，为医治各种遗传病，肿瘤等建立理论的基础。
    近年来，模拟酶的研究一直是人们关注的焦点。杯芳烃作为一种优秀的分子平台也广泛用于模拟酶的研究中。杯芳烃是一种人工合成的由取代苯酚围成的环状超分子受体化合物^[1]。杯芳烃及其衍生物的分子具有大小可调的疏水空腔，可以接纳识别大小合适的小分子，同时上下沿可以进行化学修饰，引入不同的官能团作为活性位点。因此，杯芳烃及其衍生物可以同时提供疏水环境和活性位点，从而使其在生物大分子，如蛋白质，核苷及核苷酸的催化断裂中具有广泛的应用前景^[2-7]。目前，杯芳烃衍生物的模拟酶研究主要是受人体内酶的结构的启发，在杯芳烃的骨架上引入各种金属配合物分子，使其作为催化反应的活性位点，进而研究其对DNA或者其模型物的催化水解作用等等^[8-11]。杯芳烃本身由于缺少识别基团，不能够识别指定的核苷酸或者DNA分子，从而限制了它们DNA和核苷酸定点切割中的应用，因此本文作者尝试将有机小分子引入到杯芳烃的骨架当中，使其能够识别DNA分子，进而催化DNA的断裂。这方面的工作还很少有报道^[12]。
    作者采用分子设计的方法，以杯芳烃为分子平台，以尿嘧啶作为潜在“识别子”，设计合成了含有尿嘧啶基团的衍生物UC（5-(Uracil-N¹-acetamido)-25, 26, 27, 28-tetrahydroxycalix[4]arene，即：5-(尿嘧啶-N¹-乙酰氨基)-25, 26, 27, 28-4-羟基杯[4]芳烃），并通过质谱和LB膜的方法研究了UC对核苷和碱基的选择性识别，结果证明UC可以从多种混合的碱基和核苷的溶液中，选择性的识别出腺嘌呤和腺苷（合成路线及分子结构见图1）。这部分的工作已经报道过[13]。在本文中，我们采用紫外和粘度的方法研究了UC与DNA的作用，并采用琼脂糖凝胶电泳的方法对UC催化pBR322 DNA的断裂作用进行了初步探索，希望能够为开发出一种新型的能够定点切割DNA的模拟酶试剂奠定一定的基础。

图1 UC的合成路线及分子结构图
Fig.1 The structure and synthesis route of UC

2 实验部分
2.1 仪器及试剂
    Lambda Bio 40 UV/VIS型 紫外可见光谱仪（美国PE公司）;乌氏粘度计（毛细管内径0.57mm，上海申立玻璃仪器有限公司）;DYY-11型电泳仪（北京六一仪器厂）;JY02G型凝胶成像仪（北京君意东方电泳设备有限公司）;小牛胸腺DNA（CT-DNA）购自sigma公司，pBR322 DNA购自Fermentas公司。
   其他所有使用的试剂均为市售分析纯或生物试剂，未经注明均未进行处理。
2.2 溶液的配置
2.2.1 缓冲液的配置
   所有溶液的配置均使用Tris缓冲液。
   Tris缓冲液1：含有5 ´ 10^-3mol× L^-1 Tris和0.05mol× L^-1 NaCl，用盐酸调节酸度使pH = 7.2。UC与DNA的相互作用的紫外和粘度实验均在此缓冲溶液中进行。UC先用不超过10％的DMSO溶解，再用此Tirs缓冲液定容。
   Tris缓冲溶液2. 含有0.05 mol× L^-1Tris，0.018 mol× L^-1 NaCl，用盐酸调节酸度使溶液pH = 7.2。此电泳缓冲液只适用于电泳反应液的配制。
   TBE电泳缓冲液的配置 首先将10.8 g Tris，5.5 g H₃BO₃和0.9 g EDTA溶解于1000 mL水中，配成 TBE的硼酸溶液，浓度为0.089 mol× L^-1 Tris，0.089 mol× L^-1 H₃BO₃ 和2 ´ 10^-3 mol× L^-1 EDTA（pH = 8.3）。
2.2.2 UC溶液的配置
   精确称量一定量的UC，用Tris缓冲液1配置成浓度为4´ 10^-5 mol× L^-1的溶液，用于紫外和粘度的研究实验。
   精确称量一定量的UC，用Tris缓冲液2配置成浓度为1´ 10^-4 mol× L^-1的溶液，用于琼脂糖凝胶电泳的研究实验。
2.2.3 DNA溶液的配置及浓度的确定
   称取适量的小牛胸腺DNA溶于Tris缓冲溶液 (pH =7.2)中，抽滤，将所得到的滤液按需要稀释至一定浓度。测量DNA溶液在260 nm和280 nm处的吸光度值，如果A₂₆₀ / A₂₈₀ = 1.8-1.9，说明基本上不含蛋白质，不需要再进一步处理。小牛胸腺DNA的浓度以碱基对的摩尔浓度计，测量DNA在260 nm处的吸光度，然后根据DNA在260 nm处的摩尔吸光系数6600 L× mol^-1cm^-1来确定DNA的浓度。
    [DNA]=K× A₂₆₀/6600
K为稀释的倍数。测量DNA吸光度时，如DNA浓度过高，可导致吸光度测量不准，一般应稀释到A在0.5-1之间较为合适。配制好的DNA储备液应在4 ^oC温度下保存，并于4天内使用。
2.2.4 DNA粘度的测定
   DNA溶液的粘度用乌氏粘度计测定，测定时将溶液的温度恒定在30 ± 0.1^oC。保持DNA浓度不变（[DNA]=2.5´ 10^-4mol× L^-1），改变[UC]/[DNA]的比例（[UC]/[DNA]= 0.03，0.06，0.09，0.12），测得不同UC浓度下DNA的相对粘度。测试液的相对粘度按公式h = (t – t₀) / t₀计算，其中t₀为缓冲液流经毛细管所需的时间，t为DNA溶液（含浓度不等的UC）流经毛细管所需的时间。以(h / h₀)^1/3对结合比率r (r = [UC] / [DNA])作图。h₀为未加UC时DNA溶液的相对粘度。
2.2.5 琼脂糖凝胶电泳实验
   0.8%的琼脂糖凝胶电泳，pH = 8.3的Tris-H₃BO₃-EDTA缓冲溶液作为电极缓冲溶液，溴酚蓝溶液作为电泳过程中的指示标志，向含有pBR 322 DNA 的溶液中加入一系列不同体积的化合物UC溶液，混合均匀，使反应液的终体积保持在10 mL。将制备好的电泳反应液在37° C恒温12小时，然后将此电泳反应液置于TBE电泳缓冲液中，在60V，60mA的恒压恒流条件下电泳一段时间后，以溴化乙锭为显色剂，最后用JY02G型凝胶成像仪分析结果拍摄照片。

3 实验结果及讨论
3.1 紫外光谱法研究UC与CT-DNA的相互作用
   紫外光谱法是一种有效的研究分子间作用的方法。当小分子与DNA作用时，化合物所处的环境受到DNA存在的影响，分子的紫外吸收峰会出现相应的特征变化（包括红移、蓝移或者增色、减色效应）^[14,15]。
  以Tris缓冲液1为参比，向4´ 10^-5mol× L^-1的UC溶液中滴加一定体积的DNA溶液，使得[DNA]/[UC]的比例不断增加，记录溶液在260nm处的吸光度值。表1中为不同[DNA]时，在260nm处混合体系的实际测得的吸光度值和将两者（DNA和UC）简单混合（彼此无相互作用的）的计算吸光度值（即相应浓度的DNA和UC各自单独的吸光度值之和）。

表1 不同[DNA]浓度下混合体系的吸光度值（260nm）
Table 1 the absorption of the mixture where UC (4×10^-5mol·L^-1) was mixed with different concentration of DNA

    根据上表作图（图2），从图中我们可以看出，保持UC浓度不变，当[DNA]/[UC]≤1时，随着DNA浓度的不断增大，混合体系的吸光度迅速增大，并且在[DNA]/[UC]=1时，DA / A_UC达到了57%，这说明DNA与UC之间确实发生了作用，并且生成的产物在测定波长260nm处的摩尔吸光系数比单纯的DNA或者UC的摩尔吸光系数都大。当[DNA]/[UC]> 1，随着[DNA]的增加，吸光度仍有一定的增加，但是比[DNA]/[UC]< 1时要平缓的多，基本趋平。以上结果说明，在此实验条件下，DNA与UC优先生成1：1的超分子化合物，这与以前的报道结果是相符的^[13]。但是运用紫外的方法目前尚不足以确定在此情况下UC与DNA作用的具体位点及作用模式，有待于进一步深入的研究。

图2 不同[DNA]下体系吸光度的变化图(■代表实测吸光度值；●代表计算吸光度值); 插图为吸光度变化值对[DNA]的变化曲线
Fig.2 The variation of the absorption of the mixture with increasing of the concentration of DNA(■denotes the absorption measured;●denotes the absorption calculated); Inserted was the curve of DA via [DNA]

3.2 粘度法研究UC与CT-DNA的相互作用
    粘度测试是检测小分子化合物与DNA结合模式的最有效的方法之一，其结果比光谱数据更具说服力^[16,17]。当小分子化合物以静电、沟面结合等非插入方式与DNA作用时，DNA溶液的粘度无明显变化；当小分子化合物以经典插入方式与DNA作用时，DNA相邻碱基对的距离会因小分子的插入而变大，导致DNA双螺旋伸长，使DNA溶液的粘度增加，并且结合强度越大，粘度的变化越大；而当化合物与DNA以部分插入方式作用时，则可能使DNA双螺旋发生扭结，导致DNA溶液的粘度减小。
    本节中，作者采用粘度的方法测试了UC对DNA粘度的影响,并与典型的以插入模式与DNA结合的配合物[Ru(bpy)₂dppz](ClO₄)₂比较。

图3 不同浓度的UC对DNA溶液相对粘度的影响: ■ 代表不同浓度的[Ru(bpy)₂dppz](ClO₄)₂对DNA粘度的影响；●代表不用浓度的UC对DNA粘度的影响
Fig.3 Effect of increasing amounts of UC and [Ru(bpy)₂(dppz)]²⁺ on the relative viscosity of CT-DNA at 30±0.01^oC. [DNA]=2.5×10^-4mol·L^-1

    如图3所示，我们以经典的以插入模式结合DNA的配合物[Ru(bpy)₂dppz](ClO₄)₂作为对照，随着UC浓度的不断增加，DNA溶液的粘度增大，这说明UC以插入的模式与DNA相结合，并且比[Ru(bpy)₂dppz](ClO₄)₂的插入强度更大。我们推测这可能是UC上的碱基，即尿嘧啶作为插入基团，插入到了DNA的碱基对当中。这种超分子作用说明UC中的尿嘧啶基团确实起到了识别DNA的作用，是UC与DNA结合成超分子化合物的结合位点。当然，UC插入到DNA分子中的具体位置，即DNA的接纳位点尚需进一步的确认。
3.3 UC对DNA断裂作用的研究
    琼脂糖凝胶电泳实验可以用来研究小分子化合物对DNA的断裂作用。在凝胶电泳中具有不同分子量的DNA的迁移速率是不同的，分子量越小，迁移速率越大。质粒DNA中存在三种构型。其中共价闭环的超螺旋Form I 的结构最为紧密，迁移速率最大，走在最前面。线形的Form III 走在其次。而开环缺刻的Form II 由于结构比较松散，走在最后面^[18]。
    当小分子化合物以插入模式与DNA作用时，往往会导致DNA分子的解旋和断裂，产生不同构型的DNA分子，在凝胶电泳中就会出现不同的条带。
   在前面工作的基础上，作者首先研究了不同浓度的UC对DNA的作用，发现在只有UC和pBR322 DNA存在的条件下，37^oC下恒温12小时，并没有发现pBR322 DNA发生断裂（电泳图此处未列出）。但是当向反应液中加入一定量的H₂O₂时，DNA发生了断裂。如图4所示，当只有DNA或DNA+H₂O₂存在时，DNA并没有发生断裂；而当向电泳反应液中加入UC后，DNA发生了断裂，从Form I向Form II转化，并且随着UC浓度的增加，有更多的Form I 型pBR322 DNA转变为Form II 型缺刻DNA。这说明了UC的存在，对H₂O₂断裂DNA起到了超分子催化作用，而这种催化作用来自于UC对DNA的分子识别，可以归属为一种基于分子识别的超分子催化作用^[19]。这个结果为开发新型的含有杯芳烃基团的DNA定点切割模拟酶试剂提供了理论支持。

图4 不同UC浓度下pBR322 DNA的断裂情况；条件：37^oC保温12小时；0 DNA；1 DNA+3m LH₂O₂；2 DNA+3mL H₂O₂ +10m LUC；3 DNA+3m LH₂O₂+20m LUC；4 DNA+3mL H₂O₂ +30m LUC；5 DNA+3mL H₂O₂+40mL UC；6 DNA+3mL H₂O₂ +50mL UC
Fig.4 Cleavage of pBR322 DNA in the presence of UC, kept at 37^oC for 12 hours. Lane 0: DNA alone; 1 DNA+3mL H₂O₂；2 DNA+3mL H₂O₂ +10mL UC；3 DNA+3mL H₂O₂+20mL UC；4 DNA+3mL H₂O₂ +30mL UC；5 DNA+3mL H₂O₂+40mL UC；6 DNA+3mL H₂O₂ +50mL UC

4 小结
    本文采用紫外滴定和粘度测试的方法研究了新型杯芳烃衍生物UC与CT-DNA的相互作用，结果发现：UC可以以经典插入的模式与DNA作用，并与DNA形成1：1的超分子化合物；我们推测可能是UC中的碱基尿嘧啶插入到了DNA的碱基对中间，起到了识别DNA的作用。同时，我们采用琼脂糖凝胶电泳的方法，研究了pBR322 DNA的断裂情况，结果发现：在温度37^oC条件下，UC的存在对H₂O₂断裂pBR322 DNA起到了超分子催化的作用，使DNA从闭环超螺旋的Form I 型转变为缺刻的Form II型。本文为开发新型的含有杯芳烃基团的用于DNA定点切割的模拟酶试剂提供了理论的支持。

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