Enantiomeric separation of chlorpheniramine by CE with the new type b-cyclodex trin as chiral selector

Cui Penglei^1,2 , Yang Gengliang¹ , Liu Haiyan¹ , Wei Chunliang¹
(¹Collage of pharmaceutical sciences, HeBei University, Baoding 071002; ²College of Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001)

Abstrat Bis(6-O-butene diacid ester)-b-cyclodextrin has been synthesized according to the literature and it was used as a chiral additive of capillary zone electrophoresis for the enantiomeric separation of chlorpheniramine. The separation conditions were optimized through investigation of the effects of the concentration and pH of buffer , the concentration of chiral additive and the voltage. The chlorpheniramine enantiomers can be separated on baseline under the optimum conditions. The mechanism of the chiral recognition was explored.
Keywords b-cyclodextrin; electrophoresis capillary; enantiomeric separation

新型β-环糊精衍生物在扑尔敏对映体毛细管电泳拆分中的应用

崔朋雷^1,2 杨更亮¹ 刘海燕¹ 魏春亮¹
(¹河北大学药学院 ,保定 071002; ²河北农业大学理学院 ,保定 071001)

摘要 合成了一种新型的b-环糊精（b-CD）衍生物（双（六-O-丁烯二酸单脂）-b-CD）并以其作为手性添加剂利用毛细管电泳对扑尔敏对映体进行拆分研究。考察了缓冲溶液的浓度、pH值及手性添加剂的浓度与分离电压对拆分效果的影响。在优化的条件下扑尔敏对映体得到了基线分离，对其拆分机理做了探讨。
关键词 b-环糊精; 毛细管电泳; 手性拆分

    b-环糊精(b-cyclodextrin,b-CD)及其衍生物是在毛细管电泳手性拆分研究中应用最为广泛的一类手性添加剂，目前的研究多集中在经化学修饰的β-CD衍生物上，希望通过特定结构侧链或基团的引入能在增加β-CD衍生物溶解性能的同时增强其对手性化合物的拆分能力^[1-3]。扑尔敏，又名马来酸氯苯那敏，氯屈末通，马来酸氯苯吡啶；为优良的抗组胺药物，能阻断平滑肌，内皮细胞，神经等处组织上的组胺起竞争性的抗拮作用降低机体对组胺反应，结构式见图1。扑尔敏是手性分子，含R和S型。本研究参考有关文献^[4]合成了双（六-O-丁烯二酸单脂）-b-CD（以前未见将其做为手性添加剂用于毛细管电泳的报道），将自制的双（六-O-丁烯二酸单脂）-b-CD做手性添加剂，采用毛细管电泳法对扑尔敏对映体进行了拆分，取得了较好的效果。

图1 扑尔敏的结构
Fig.1　Structure of chlorpheniramine

1 实验部分
1．1 仪器与药品  
    毛细管电泳仪:美国Waters公司生产的高效毛细管电泳系统(WatersQuanta 4000E CapillaryElectrophore-sis System),内设恒温系统和固定波长紫外检测器;未涂层熔硅弹性石英毛细管（内径75mm,柱长60cm,有效柱长52cm,河北永年光纤厂），PH-3C型酸度计（上海雷磁仪器厂），BS210S型电子天平（北京塞多利斯天平有限公司）;紫外检测波长设在254nm，检测灵敏度为0.005AUFS，数据采集和处理由CKChrom Chromatography Data System色谱软件完成。扑尔敏外消旋体(中国药品生物制品检定所,纯度>99%)实验室中所用的其它药品均为分析纯；水为二次去离子水; FTIR红外光谱仪(Perkin2E1mer公司)，WRT23P微量热天平(上海精密科学仪器有限公司)。β-环糊精(北京双旋微生物培养基制品厂)；顺丁烯二酸酐(天津市科密欧化学试剂开发中心); 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（北京益利精细化学品有限公司）
1．2 双(六-O-丁烯二酸单酯)-b-CD的合成
    按照文献^[4]合成（反应式如图2），称取 4.5 g 重结晶两次的b-CD 和 5.5 g 顺丁烯二酸酐 ，置于大研钵充分研磨10min ，将已经混合均匀的反应物转入250 mL锥型瓶 ,80℃水浴恒温反应 ，每间隔3min搅拌约1.5min ，约2 h后 ,粘稠液变成固体，停止搅拌，继续反应6h。冷却至室温，加100 mL乙醇浸泡，抽滤，真空干燥，得到白色的固体即为双(六-O-丁烯二酸单酯)-b-CD（BDE-b-CD）。红外光谱分析结果为g_max3385cm^-1(OH,s),2928cm^-1(CH₂,w),1726cm^-1 (CO,m),1637cm^-1(CO,s),1416cm^-1 (COO- ,w)。元素分析结果( %,C₅₀ H₇₄ O₄₁·8H₂ O) C,40.80(40.70) ;H ,6.45(6.11)。热重分析发现衍生物在230℃时才开始失重，具有良好的热稳定性，该b-CD衍生物具有良好的水溶性，利于在水相中应用。

图2 双（六-O-丁烯二酸单脂）-b-CD的合成
Fig.2 Synthesis of bis(6-O-butene diacid ester)-b-cyclodextrin

1．3 扑尔敏的毛细管电泳拆分
    选用Tris-磷酸缓冲液做为背景电解质，将自制的BDE-b-CD溶于此缓冲液中，样品溶液及缓冲液均经0.45μm滤膜过滤后，超声脱气五分钟，备用。毛细管柱使用前分别用0.1mol/LNaOH溶液，二次去离子水各冲洗5min，再用运行缓冲液平衡5min。每两次运行之间用二次去离子水和运行缓冲液各冲洗2min,采用重力进样，进样时间5s，254nm柱上检测。

2 结果与讨论
2.1 手性选择剂浓度对分离的影响
　 手性选择剂的浓度是影响分离的一个重要因素。手性试剂浓度太低，对映体的分离效果差；手性选择剂浓度过高，影响缓冲液的电渗流，溶液中各组分的电泳淌度也发生变化，从而影响分离度。Wren等^[5]认为在手性分离中总存在一个最佳的手性选择剂浓度,结合常数愈大,最佳浓度愈低，反之亦然. 本实验考察了在90mmol/LTris-H₃PO₄(PH=3.5)介质中，手性选择剂的浓度对分离的影响。结果发现当BDE-b-CD 浓度小于15mmol/L时，扑尔敏对映体得不到分离；当BDE-b-CD浓度超过20mmol/L时，扑尔敏对映体亦得不到分离，随着b-CD浓度的增加出峰时间逐渐拖后并且浓度太大时会出现托尾现象。在兼顾分离度和出峰时间的前提下，本实验选中选择b-CD的浓度为15mmol/L(见图3)。

图3　BDE-b-CD的浓度对扑尔敏对映体拆分的影响
Fig.3 Effect of concentration of BDE-b-CD on the resolution of chlorpheniramine

2.2 运行缓冲液的浓度及PH值对分离的影响
   缓冲液的浓度对分离也产生了很大的影响，本实验考察了电泳介质中Tris的浓度分别为50-100mmol/L时扑尔敏对映体的分离情况，实验结果表明：当Tris浓度小于90mmol/L时，扑尔敏对映体得不到分离；Tris浓度大于90mmol/L后，对映体达到基线分离，且Tris浓度越高，分离度越好，但出峰时间越长并出现峰拖尾现象，本实验中选择Tris浓度为90mmol/L（图4）。缓冲液PH值影响待分离物质的电荷及电渗流，是影响手性分离的重要参数之一。考察了缓冲溶液PH值对分离的影响，PH值过高扑尔敏对映体得不到分离，在pH =3.5的条件下, 扑尔敏对映体可达基线分离，而PH进一步降低时，电渗流减小，分析时间延长，且Rs呈下降趋势,所以选择PH=3.5为分离酸度。
2.4 运行电压、进样时间及温度对分离的影响
    加大电压，可提高分离度，缩短分析时间。但在过高的电压下，电泳电流显著增加，柱效和分离度反而降低。在考虑上述因素的情况下，本实验中选择分离电压为14KV。
   进样时间决定了进样量的大小。进样量太小，达不到检测器的灵敏度；进样量太大，样品塞长度超过扩散引起的区带增宽，分离效率和分离度都会变差。本实验中选择5s为最佳进样时间。
    柱温升高，溶液的粘度降低，导致EOF增大。本实验结果表明在14 kV电场强度下，温度在20－35℃范围内，对分离度影响不大。故选择25℃作为分离柱温。
2.5优化条件下的典型电泳分离图（见图4）
    BDE-b-CD作为手性添加剂用于拆分扑尔敏对映体的优化条件为：Tris-磷酸90mmol/L，PH=3.5，BDE-β-CD浓度为15mmol/L，电压为14KV，重力进样5s，25ºC。

图4 扑尔敏的电泳分离图
Fig.4　Capillary electrophoretogram of chlorpheniramine
15mmol/L BDE-b-CD，90 mmol/LTris－H₃PO₄(PH=3.5), 14kv，25ºC

5 机理探讨
    从结构上看，b-CD及其衍生物都是由7个吡喃葡萄糖单元以a-1, 4键合的环状产物，用顺丁烯二酸酐对b-环糊精进行改性，引入了C=C键及羧基作为侧链，对环糊精的空腔大小、分子形状以及极性等都产生了影响。扑尔敏与β-CD作用时，分子中氯代苯基团深入b-CD空腔，形成疏水包合；吡啶环与手性碳原子所连的基团可与BDE-b-CD内腔及边缘上仲羟基形成静电、氢键和范德华作用，由于BDE-b-CD衍生物中侧链碳碳双键及羧基的引入加大了分子的口径和深度，且衍生化后的CD柔性增加，使主客体分子之间的相互作用点增加，作用力增强，更易与手性中心相连的基团发生相互作用，所以自制的b-CD衍生物对手性分子对映体有较好的拆分效果。

REFERENCES
[1]Masurier N, Estour F, Froment M T, et al. Eur J Med Chem, 2005, 40: 615-623.
[2]Peroche S, Degobert G, Putaux JL,et al. Eur J Pharm Biopharm, 2005, 60: 123-131.
[3]Lesur D, Gassama A, Moreau V, et al. Carbohydr Res, 2005, 340: 1225-1231.
[4] 黄　姣, 陈小明, 罗和安, 罗伟宁 分析科学学报, 2005, 12: 646.
[5] Wren SAC, Rowe RC. J Chromatogr A, 1992, 603(1-2): 235-241.