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May 1,
2002 Vol.4 No.7 P.35 Copyright |
(Dapartment of Food Science And Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Huhehot 010018) Abstrct In this paper，19 strain yeasts were isolated from 15 samplies of Koumiss that were taked from grassland in Inner Mongolia．Generic Identification were researched through studing forms and biological properties．Still one strain could not be difined generitype．Meanwhile, antibacterial action to E.coli、Listeria and Staphylococcus aureus were studied．Five strain yeasts which have antibacterial action were selected．The study aimed to provide basis for further studing of functional properties of koumiss and exploitation of Yeast antibiotic．
Keywords Koumiss yeast, Yeast antibiotic 酸马奶中酵母菌的分离、鉴定及抗菌特性研究 母智森 赵美霞 白英 贺银凤
（内蒙古农业大学食品科学与工程系，呼和浩特，内蒙古，010018）
2002
年1月22日收稿;国家自然科学基金项目(批准号：29966003).摘要 从内蒙古牧区采集的15个酸马奶样中分离得到19株酵母菌。通过对其形态、培养特征等的研究进行了属的鉴定，其中一株未能定属。同时研究了对E.coli、Listeria、Staphylococcus aureus三种致病菌的抑菌作用，从中选出五株有抑菌作用的酵母菌，为酸马奶功能特性的深入研究以及新型抑菌素的开发提供技术依据。
关键词 酸马奶 酵母菌 酵母抑菌素
传统的酸马奶是由鲜马奶加入天然发酵剂经自然发酵而形成。呈乳白色、均一的含气乳饮料。蛋白质颗粒细腻，气味辛辣提神。成品酸度为100-140°N。酒精含量为0.5-2.5%(V/V)。
酸马奶是一种古老的乳饮料，在东欧和亚洲比较流行。早在2500年前，游牧在俄罗斯东南和中亚的塞西亚部落就以酸马奶的形式饮用马奶。至今仍为中亚、西伯利亚以及俄罗斯南部居民上等的保健饮品。我国的蒙古族、咯萨克族等民族在远古时代就有制作和饮用酸马奶的习惯[1]，至今盛行不衰。
酸马奶是营养价值很高的具有民族特色的高级活性保健饮料，具有驱寒、舒筋、活血、补肾、消炎、健胃等效用。蒙医往往用它掺上维生素C和一些消炎药品治疗胃病、心血管病、腰腿疼和结核病。我国内蒙古锡盟蒙医研究所对马奶酒的药用价值、临床治疗都有了卓有成效的研究，发现马奶酒不仅能降血脂、促进新陈代谢，改善胰腺功能，提高人体免疫力，对结核病也有治疗作用[2]。有关酸马奶中酵母菌的报道，如卡里塞夫瓦（Khrisanfova）研究了酸马奶的微生物组成，发现其中的酵母菌主要是3种：乳酸酵母、软骨状酵母、和醭酵母[1]。斯科罗多莫瓦（Skordumova）从酸马奶中分离到对结核杆菌和其它有害微生物有较高抑制活性的酵母菌[1]。J．H．Fleet报道了酵母菌在干酪中的繁殖和代谢作用能抑制腐败微生物和梭状芽孢杆菌的生长[3]。罗珍兰报道了酵母菌在发酵乳制品中的有益作用[4]。但以往报道没有较系统地阐明酸马奶中酵母菌组成、特性及抑菌范围。本研究对分布在我国内蒙古锡林郭勒草原牧区的酸马奶中的酵母菌进行了较系统的研究。分离、纯化并鉴定了马奶酒中的酵母菌种属，并对其发酵特性及抑菌特性做了初步研究。为酸马奶抗菌特性的系统研究和酵母菌抑菌素的开发奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 样品
采自内蒙古锡林浩特市周边牧区、正兰旗、阿旗等不同地区的15个牧民家庭，共收集15个样品。上述样品无菌采集后立即放入盛有适量保护剂的无菌瓶中，置于4℃保温箱内。
1．2 菌种
金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus）、菌致病性大肠杆菌（E.coli）、李斯特菌（Listeria）标准菌株由内蒙古农业大学动物科学与医学院提供。
1．3 培养基
1．3．1 鲜马奶液体培养基
鲜马奶
1．3．2 1号培养基
5Br新鲜麦芽汁300ml，酵母膏3g，蛋白胨5g，乳糖10g，琼脂20g，蒸馏水700ml，PH6.0
1．3．3 马铃薯培养基
日本日水制药株式会社提供。
1．3．4 鉴定培养基及抑菌用培养基
均按文献[5,6]配制。
1．3．5 Gorodkowa琼脂培养基
葡萄糖1g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml
1．3．6 麦芽汁-酵母膏-葡萄糖-蛋白胨琼脂培养基
按文献[5]配制。
1．4 试剂
2%美兰染色液，3%碘化钾，林格氏碘液（碘5g，碘化钾10g，蒸馏水100ml），重氮基蓝B液（在冷的0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，Ph7.0，每ml含1mg），甲液（对氨基苯磺酸0.8g，5N醋酸溶液100ml），乙液（a-萘胺0.5g，5N醋酸溶液100ml）
1．5 主要仪器
Olympus-CO11普通光学显微镜（日本），OLYMPUS-BX50显微照相仪（日本），EYE旋转蒸发仪（日本），NSO-IIA-1200超净工作台（日本），MIR-1620恒温培养箱（SANYO），CS-15R离心机（日本）。
1．6 实验方法
1．6．1 酵母菌分离纯化
菌种的分离分两次进行，一次在取样后进行（现场），一次在取样后24hr（实验室）。用划线法分别把样品接种在马铃薯培养基和1号培养基上，在18℃，24℃，28℃三种温度条件下培养1～3d。挑取酵母菌可疑菌落，经美兰染色后作显微镜观测，将确认菌落接种于1号培养基上，纯化两次。然后穿刺接种到1号半固体培养基上，25℃培养36hr后置于4℃冰箱备用。
1．6．2 菌落特征的观察
被检菌划线接种在马铃薯琼脂培养基，25℃下培养ld～3d，记录菌落的颜色，质地，大小，气味等特征。
1．6．3 细胞形态的观察
将被检酵母菌接种到1号固体培养基上，25℃下培养24-48h。美兰染液染色后作显微镜观察。
1．6．4 子囊孢子形态观察
酵母菌划线接种于Gondkowa氏琼脂斜面上，25℃培养3～5d。具体操纵如下：在培养皿内铺2张滤纸、放置灭菌载玻片，用无菌吸管吸4～5ml热的Gondkowa氏琼脂均匀涂布于载玻片上，待冷却后划线接种Gondkowa琼脂斜面上生长良好的酵母菌，覆盖无菌盖玻片。培养皿中注入2ml无菌水浸渗滤纸，盖好平皿。25℃培养3天后取出镜检。若无子囊孢子形成的酵母菌株，改为20℃培养，每周观察一次，持续6周，记录子囊孢子的形态、个数等特征。
1．6．5 菌丝观察
载玻片培养法 在培养皿内铺2张滤纸、放置灭菌载玻片，其上涂布马铃薯琼脂培养基(3-5m1)，完全凝固后，用灭菌毛细管滴一滴被检酵母菌液体培养物，然后盖好灭菌盖玻片，培养皿中注入2ml无菌水浸渗滤纸，25℃下培养1周，观察菌丝生长情况。
1．6．6 掷孢子的形成试验
将被检酵母菌接种于双层马铃薯固体平板培养基上，25℃培养3周，若能射出掷孢子可在对面平皿盖上形成与菌落形状相同的镜像，说明此酵母菌产生掷孢子。可进一步观察掷孢子的形状和大小。
1．6．7 糖发酵试验
按文献[6]方法。将被检酵母菌分别接种在含乳糖和葡萄糖的液体培养基中，25℃下培养，从第2d开始观察，一直观察到第7d判定结果，管内有气体者判为产气，记为阳性“+”,否则记为阴性“-”。阴性对照管中不含糖。
1．6．8 硝酸盐还原试验
将被检酵母菌接种在硝酸盐培养基中，25℃下培养1d～7d，隔日吸取培养液2ml，滴加甲、乙混合液（1：1）。呈现红色为阳性，记为“+”,否则记为阴性“-”。
1．6．9 类淀粉物质生成
将酵母菌接种在Gorodkowa液体培养基中，25℃培养3d～1周，第3天、滴入林格氏碘液，摇匀酵母发酵液和林格氏碘液混合液，呈现蓝、紫或绿色记为阳性“+”，否则记为“-”。1周后记录试管内沉淀部分，呈褐色记为“-／+”，否则为“-”
1．6．10 脲酶实验
脲素液体培养基提前置于冰箱内深度冷冻六周后取出，接种酵母菌，37℃培养，每半小时检查一次，观察试管颜色变化，红色表明脲酶活性，记为阳性“+”，否则为阴性“-”，持续2小时。
1．6．11重氮基蓝B（DBB）实验
将酵母菌在麦芽汁-酵母膏-葡萄糖-蛋白胨琼脂培养基上，25℃培养10d，取出后在55℃下3hr，然后浸没在4℃的DBB试剂中。室温下，培养物在2分钟内变成暗红色，记为阳性“+”，否则为阴性“-” 。
1．6．12抗菌液制备
将酵母菌接种在鲜马奶液体培养基中，25℃下培养36hr。发酵液离心（3000rmp，10min），取上清液，调PH值到7.0。用旋转蒸发仪将上清液浓缩到原来体积的三分之一，同时排除酒精（浓缩温度：28℃，真空度：660mmHg）。
1．6．13 抑菌实验（牛津杯法）
选择李斯特菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌作指示菌株，进行抑菌试验。活化后的三株指示菌各取一接种环，用lml生理盐水稀释，摇匀后吸0．1ml至培养基上，推捧推匀，安放牛津杯，每皿4个，等间隔排开，将制备好的抗菌液注入牛津杯，加入量为0．2ml。每个牛津杯设对照样。37℃培养24h，牛津杯周围有明显透明区域者记为阳性“+”，用mm刻度尺量取抑菌圈直径，否则为阴性“-”。
2．结果
2．1 菌落特征、菌体形态及繁殖特点
从15个酸马奶样品中分离得到19株酵母菌。经菌落特征、菌体形态及繁殖特点等的观察（表1）可以看出，酸马奶中的酵母菌菌落色泽多为乳白、灰白，其中一株为红色。菌落表面呈光滑和不光滑两种情况。细胞形态呈多样性，有圆形、椭圆、柠檬形、棒状、瓜子形等。无性繁殖均为芽殖，无掷孢子。菌丝和子囊孢子也呈现多样性。
表1 酵母菌形态鉴学定结果
菌株号 |
菌落 色泽 |
菌落 表面 |
细胞形态 |
无性繁殖方式 |
菌丝 |
掷孢子 |
子囊孢子 |
1 |
灰白 |
光滑 |
棒状 |
芽殖 |
有隔 |
无 |
1～4个礼帽形 |
2 |
乳白 |
不光滑 |
椭圆 |
芽殖 |
假 |
无 |
1～2个圆形 |
3 |
乳白 |
不光滑 |
瓜子形或棒状 |
芽殖 |
无 |
无 |
1个卵圆 |
4 |
灰白 |
不光滑 |
柠檬形 |
芽殖 |
有隔 |
无 |
无 |
5 |
灰白 |
光滑 |
小椭圆 |
芽殖 |
假 |
无 |
无 |
6 |
红色 |
光滑 |
大椭圆 |
芽殖 |
无 |
无 |
多个圆形 |
7 |
乳白 |
光滑 |
小椭圆、尖顶 |
芽殖 |
假 |
无 |
1～4个圆形 |
8 |
乳白 |
光滑 |
椭圆 |
芽殖 |
有隔 |
无 |
1～4个圆形 |
9 |
乳白 |
不光滑 |
卵圆或柠檬形 |
芽殖 |
无 |
无 |
1～4个圆形 |
10 |
灰白 |
不光滑 |
小椭圆 |
芽殖 |
假 |
无 |
无 |
11 |
乳白 |
不光滑 |
椭圆 |
芽殖 |
无 |
无 |
无 |
12 |
乳白 |
不光滑 |
棒状或柠檬形 |
芽殖 |
假 |
无 |
4个圆形 |
13 |
灰白 |
光滑 |
圆形 |
芽殖 |
无 |
无 |
无 |
14 |
乳白 |
不光滑 |
柠檬形 |
芽殖 |
无 |
无 |
1个圆形或长圆 |
15 |
灰白 |
不光滑 |
椭圆或柠檬形 |
芽殖 |
无 |
无 |
1～2圆形 |
16 |
乳白 |
不光滑 |
椭圆尖顶 |
芽殖 |
无 |
无 |
1个卵圆 |
17 |
乳白 |
不光滑 |
小椭圆 |
芽殖 |
无 |
无 |
1个圆形或卵圆 |
18 |
乳白 |
不光滑 |
小椭圆 |
芽殖 |
假 |
无 |
无 |
19 |
乳白 |
不光滑 |
椭圆 |
芽殖 |
无 |
无 |
1个圆形 |
2．2 生理生化特征
按J．Ａ．巴尼特[6]方法，对19株酵母菌进行了初步的生化实验观察（表2）。19株酵母菌的硝酸盐还原实验、BDD、脲酶实验均为阴性。且均能发酵乳糖和葡萄糖。类淀粉物质的产生，除2号和3号菌呈现“－/+”外，其余均为阴性。5株均对大肠杆菌有抑制作用。19株酵母菌对李斯特菌均无抑制作用。
表2 生理生化鉴定结果
菌株号 |
硝酸盐还原 |
类淀粉物质形成 |
脲酶 |
乳糖发酵 |
葡萄糖发酵 |
DBB |
1 |
|
|
- |
|
|
－ |
2 |
|
|
- |
|
|
－ |
3 |
|
|
- |
|
|
－ |
4 |
|
|
- |
|
|
－ |
5 |
|
|
- |
|
|
－ |
6 |
|
|
- |
|
|
－ |
7 |
|
|
- |
|
|
－ |
8 |
|
|
- |
|
|
－ |
9 |
|
|
- |
|
|
－ |
10 |
|
|
- |
|
|
－ |
11 |
|
|
- |
|
|
－ |
12 |
|
|
- |
|
|
－ |
13 |
|
|
- |
|
|
－ |
14 |
|
|
- |
|
|
－ |
15 |
|
|
- |
|
|
－ |
16 |
|
|
- |
|
|
－ |
17 |
|
|
- |
|
|
－ |
18 |
|
|
- |
|
|
－ |
| 19 | - | - | - | + | + |
－ |
2．3 酵母菌属的鉴定结果
根据J．Ａ．巴尼特[6]方法，19株酵母菌经属的初步鉴定如（表3）。其中内孢霉酵母属1株，德巴利酵母属1株，类酵母属3株，克勒克酵母属2株，酒香酵母属4株，酵母属1株，毕赤氏酵母属1株，有孢酵母属2株，厚壁酵母属2株，接合酵母属1株，其中6号为未定菌株。
表3 酵母菌属的鉴定结果
菌 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
19 |
菌 属 |
内孢霉酵母属 |
德巴利酵母属 |
类酵母属 |
克勒克酵母属 |
酒香酵母属 |
未定 |
酵母属 |
毕赤氏酵母属 |
有孢酵母属 |
酒香酵母属 |
克勒克酵母属 |
类酵母属 |
酒香酵母属 |
厚壁酵母属 |
类酵母属 |
有孢圆酵母属 |
接合酵母属 |
酒香酵母属 |
厚壁酵母属 |
2．4 抑菌实验结果
从表4可以看出，19株酵母菌有较明显抑菌作用的菌株为5号、6号、12号、13号和14号，且抑菌作用具有明显的针对性，其中13号和14号对金黄色葡萄球菌有明显的针对性。
表4 酵母菌抑菌作用（抑菌圈直径mm）
菌种号 |
金黄色葡萄菌 |
|
|
1 |
|
|
|
2 |
|
|
|
3 |
|
|
|
4 |
|
|
|
5 |
|
|
|
6 |
|
|
|
7 |
|
|
|
8 |
|
|
|
9 |
|
|
|
10 |
|
|
|
11 |
|
|
|
12 |
|
|
|
13 |
25.3±0.2 |
|
|
14 |
20.1±0.3 |
|
|
15 |
|
|
|
16 |
|
|
|
17 |
|
|
|
18 |
|
|
|
19 |
|
|
|
3 讨论
3．1 酵母菌的分离与鉴定
菌种的分离应尽可能做到全面、细致、不丢、不重，为此在本实验中，对样品进行了两次分离，一次在取样现场，一次在样品带回实验室进行。分离所用的温度为18℃，24℃，28℃三个温度梯度，涵盖了大多数酵母菌生长的温度范围。自然发酵的酸马奶，其发酵温度（采样温度）一般为18～22℃。培养基对酵母菌的分离很重要，本实验中选用1号培养基和马铃薯培养基两种培养基，其中1号培养基为本实验室模拟马乳营养改良的一种专用培养基，实验证明，效果良好。
根据《酵母菌特性及鉴定手册》[6] 介绍的方法，酵母菌属的鉴定主要以形态学特征为主，并结合生理学特征。形态学特征包括细胞形态、子囊孢子、菌丝、掷孢子以及培养特征等；生理学特征包括葡萄糖发酵、脲酶实验、类淀粉生成、DBB等。从实验结果可以看到酸马奶中酵母菌形态各异，种类繁多，而且不同样品中酵母菌的组成不同，这可能是不同地区、不同牧民家庭所制作的酸马奶风味不同的原因之一。
本实验中，6号菌株未能定属，其原因是按文献[6]方法，实验结果与标准不符。这可能与实验结果的准确性有关，也可能属新菌株。
3．2 抑菌作用
新鲜的酸马奶具有较强的抗菌性，而且抗菌范围广，其抗菌作用是酒精、酸、乳酸菌、酵母菌等微生物及其代谢产物共同作用的结果。酵母菌的抑菌素是一种新型抑菌素，对形成酸马奶的抗菌体系起着重要的作用。本实验采用经离心、蒸馏、调酸的酵母发酵液，排除了酸、酒精和大分子物质的干扰。可以证实酸马奶中的某些酵母菌确有抑菌作用，这为新一代抑菌素-酵母抑菌素的开发提供了依据。此外，实验结果显示，在实验所选用的指示菌中，酸马奶中具有抗菌作用的酵母菌比例较少，而且抑菌范围窄，这可归结为两方面的原因：其一是酸马奶中酵母菌本身特性所决定，其二是所选用的指示菌范围窄，不足以说明问题。对其它有害菌的抑菌特性有待进一步证实。
4 结论
酸马奶中酵母菌种类多，组成复杂。不同样品中酵母菌的组成不同。
从15个样品中分离得到的19株酵母菌，经属的初步鉴定，其结果为：内孢霉酵母属1株，德巴利酵母属1株，类酵母属3株，克勒克酵母属2株，酒香酵母属4株，酵母属1株，毕赤氏酵母属1株，有孢酵母属2株，厚壁酵母属2株，接合酵母属1株，其中6号为未定菌株。
19株酵母菌中有较明显抑菌作用的菌株为5号、6号、12号、13号和14号，其中13号和14号对金黄色葡萄球菌有抑制作用，5株均对大肠杆菌有抑制作用，19株酵母菌对李斯特菌均无作用。
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