Lin Jianqing, Hong Huasheng, Wang Xinhong, Liu Rixian, Wang Kejian
(Xiamen University, Key Laboratory for Marine Environmental Science of Ministry of Education/Environmental Science Research Center, Xiamen, Fujian, China 361005 )

Abstract 1-pyrenol measurement was optimized by means of 3D fluorescence scan, the result showed that 1-pyrenol fluorescence measurement at lex/lem 277/386 nm was more sensitive than that at lex/lem 341/383 nm, and the linear correlation between 1-pyrenol concentration and fluorescence value was good ( C(ng/mL)=0.0215×F-0.8722, R²=0.9927). The experiments were done on the recovery of 1-pyrenol standard addition to bile samples, the recovery of 1-pyrenol of standard addition was 95.4% and 98.5% respectively. Weever was used in the experiments to test the relationship between pyrene exposure (0, 0.1, 1.0, 10.0 mg/L pyrene) in seawater and 1-pyrenol concentration in fish bile. The result showed that the correlation was significant (correlation coefficient 0.9995); this indicated that 1-pyrenol concentration in fish bile could be used as biomarker to indicate pyrene exposure level in marine environment.
Keywords 1-pyrenol, pyrene, biomarker, 3D fluorescence scan, fish bile

以鲈鱼胆汁中的1－羟基芘含量来指示水体中芘暴露水平的研究

2002年3月10日收稿，国家自然科学基金资助项目(A20077023 ，C40106012)

摘要 以三维荧光扫描为手段，对1－羟基芘的荧光测定条件进行了优化。实验结果表明：在lex/lem 277/386 nm时，1－羟基芘的荧光测定灵敏度比在lex/lem 341/383 nm时好；1-羟基芘的浓度与荧光值的线性关系良好（C(ng/mL)=0.0215×F-0.8722, R²=0.9927）。进行了1－羟基芘的标准加入回收实验；1－羟基芘的回收率均达到95％。以鲈鱼为实验鱼研究了水体中芘暴露水平与胆汁中的1－羟基芘含量的相关性；结果显示两者之间具有显著的相关性（相关系数为：0.9995）；这提示可以通过测定鱼胆汁中的1－羟基芘的含量来指示水生环境中的芘暴露水平。
关键词 鲈鱼，胆汁，三维荧光扫描，1－羟基芘

    多环芳烃（PAHs）是一类广泛分布于自然界的痕量有机污染物，其主要来源于人类的活动—油料、木材和其它有机材料的不完全燃烧过程^[1]。这些物质通过工业废水的排放，溢油事件，大气的干、湿沉降和地表水的冲刷等途径进入水生环境。PAHs存在于水体、沉积物及水生生物体内，对于工业化程度高的地区其污染尤为严重^[2,3]。由于对生物体的致癌性、致突变性和生物富集效应，PAHs的研究备受关注^[4]。过去，环境监测的研究主要集中在监测污染物的浓度及存在形式，这些研究只能给出污染物的某一方面的信息，而不反映对生物体的效应。为了弥补这方面的不足，近来更多的环境监测研究将化学污染物的监测与污染物的暴露及/或效应的生物标志物连接在一起研究^[5,6]。这种研究已经证实是一种评价水生生态环境的有效方式^[7]。鲈鱼是我国近海养殖经济鱼类中的重要品种，对水环境中的PAHs容易进行富集和代谢，其中间体能够与肝中的DNA结合或形成共价结合产物，进而排入胆汁中，因而胆汁中的PAHs代谢产物的组成和浓度可以用来指示环境中的PAHs暴露水平。本文运用三维荧光扫描手段对1－羟基芘的荧光测定条件进行了优化，并以鲈鱼为实验鱼研究了水体中的芘暴露水平与胆汁中1－羟基芘含量的相关性。

1 材料和方法
1.1　主要仪器及试剂
    仪器名称：F-4500 型荧光分光光度计（日本日立公司，以Xe灯为光源）
    仪器参数： Ex slit: 2.5 nm, Em slit: 5.0 nm, PMT V: 700, Delay time: 1, Integration time: 2.0, shutter control, response :auto。
    主要试剂：1－羟基芘(Aldrich公司产品)，1－羟基萘，芘（为Sigma公司产品），乙醇、丙酮为分析纯，Milliq 水。
    标准溶液：以48％ 的乙醇溶液为溶剂，配制成浓度分别为：0，2.0，5.0，7.0，10.0，20.0，50.0，70.0，100.0，1000.0（ng/mL）的1－羟基芘10种标准溶液；以及浓度为：0.10 mg/mL的1－羟基萘标准溶液。
1.2　鲈鱼的毒性实验方法   
    取鲈鱼10条（每条150～200g），于沙滤的海水中暂养3天。更换沙滤的海水。将鲈鱼分成5组（每组2条）分别置于体积为200 L的大玻璃缸中进行毒性实验，分组如下：第1组为空白对照组，海水中不加任何毒物；第2组为丙酮对照组，在100L的海水中加入0.5 mL 的丙酮；第3组为海水含芘浓度为0.1m g/L，第4组为海水中含芘浓度为1.0 m g/L，第5组为海水中含芘浓度为10.0 m g/L。实验过程中充氧，但不投食；暴露48小时后迅速进行解剖，取胆汁，并以48％ 的乙醇溶液按1:1600的比例进行稀释，稀释后的样品直接进行荧光测定。
1.3 1－羟基芘的三维荧光扫描
  1－羟基芘溶液的浓度：20.0 ng/mL，仪器参数见1.1, 扫描参数：Data Mode: Fluorescence, Scan speed: 1200；EX Start WL: 200 nm, EX End WL: 400 nm; Sampling interval: 5 nm. EM Start WL : 200 nm, EM End WL : 500 nm; Sampling interval: 5 nm.
1.4  1-羟基芘的标准工作曲线    
    分别移取上述前9种的1－羟基芘标液，在lex/lem 277/386 nm处读取1－羟基芘的荧光值，以荧光值为横坐标，1－羟基芘的浓度值为纵坐标，制作标准曲线。
1.5 鲈鱼胆汁中的1－羟基芘的荧光测定
    取配制好的胆汁样品，分别在lex/lem 277/386 nm处读取1－羟基芘的荧光值，根据标准曲线计算样品中的1－羟基芘的含量。
1.6  标准加入的回收率实验       
    取1.0 m g/mL的1－羟基芘标液50 m L 与胆汁样品（第4组中的第1个样品）2.0 mL混合得到混1试液，在l ex/l em 277/386 nm处测定1－羟基芘的荧光值并计算标准加入的回收率；取1.0 m g/ml的1－羟基芘标液50.0 m L，0.1 mg/mL的1－羟基萘标液50.0 m L及胆汁样品（第4组中的第2个样品）2.0 mL混合得到混2试液，在l ex/l em 277/386 nm处测定1－羟基芘的荧光值并计算1－羟基芘标准加入的回收率。

2 实验结果和讨论
2.1 1-羟基芘的最佳lex/lem的选择             
    以浓度为20.0 ng/mL的1－羟基芘溶液进行三维荧光扫描，扫描结果可以看出1－羟基芘有3个荧光峰；再在荧光峰附近选择激发和发射波长测定荧光强度，得出荧光峰的精确位置和荧光强度。结果如下：一个峰为：lex/lem 277/386 nm（A峰）, 荧光强度为1048；一个峰为：lex/lem 341/386 nm（B峰），荧光强度为603.6；另外还有一个峰为：lex/lem 240/386 nm（C峰）, 荧光强度为2263。从1－羟基芘的三维荧光扫描结果可以看出，荧光光谱并不随着激发波长的改变而改变，1－羟基芘的荧光峰均在386 nm；而溶剂的拉曼峰则随着激发光波长的改变而改变；当用波长较长的激发光进行激发，溶剂的拉曼峰将向长波方向移动。因此，选择的激发光波长越接近该物质的荧光发射波长，则由溶剂的拉曼峰引起的误差则较严重。从图1和图2的结果也表明了这一点。考虑溶剂的拉曼效应，选择277 nm为激发光时，由溶剂的拉曼效应带来的干扰比选择341 nm 为激发光带来的干扰要小。考虑荧光峰的灵敏度和选择性，C峰的荧光强度最大，但是C峰的激发波长为240 nm，在实际样品测定时许多组分均可在此波长下激发而产生荧光，可能受到的各种干扰较为严重，因而不选择240 nm为1－羟基芘的荧光激发波长。从扫描结果（图1和图2）看，选择277 nm激发光产生的荧光峰比选择341 nm为激发光产生的荧光峰要强，因此，1－羟基芘的最佳lex/lem选择为277/386 nm。这与Aas E等人^[5]的优化结果有所差异。Aas E等人^[5]采用同步荧光扫描对芘代谢产物的荧光测定条件的优化结果为：lex/lem 341/383 nm，而我们通过比较两者（A峰和B峰）的荧光强度得出，在lex/lem 277/386 nm处测定1－羟基芘的含量更为灵敏（lex/lem 341/386 nm ：C(ng/mL)= 0.0466´ F - 0.531， R² = 0.9968；lex/lem 277/386 nm: C(ng/mL)=0.0215´ F-0.8722, R²=0.9927）；从方程的比较上可知：1－羟基芘在lex/lem 277/386 nm测定的灵敏度比在lex/lem 341/383 nm 测定的灵敏度要高一倍。

2.2 1-羟基芘的标准工作曲线        
    在实验条件下， 1-羟基芘在0～100 ng/mL浓度范围内线性关系良好（R²=0.9927），其一元线性回归方程为C=0.0215´ F-0.8722 (C为样品中1－羟基芘的浓度，单位为 ng/mL；F为样品在l ex/l em 277/386 nm测得的荧光值)，以所得的荧光信号标准偏差的3倍计算出来的检出限为0.91 ng/ml。从以上的结果可知，运用荧光方法测定样品中的1－羟基芘具有较好的灵敏度和精密度。

图3 1－羟基芘的标准工作曲线

2.3 1－羟基芘的标准加入的回收实验              
    混1试液为胆汁样品（第4组中的第1个样品2.0 mL，1-羟基芘的测定结果为9.74 ng/mL）外加1.0 m g/mL的1－羟基芘标液50.0 m L（相当于加入1－羟基芘50 ng）。混1试液中1－羟基芘的测定结果为 32.78 ng/mL，标准加入的1－羟基芘的回收率为95.44%。
    混2试液为胆汁样品（第4组中的第2个样品2.0 mL, 1-羟基芘的测定结果为11.63 ng/mL）外加1.0 m g/mL的1－羟基芘标液50.0 m L（相当于加入1－羟基芘50 ng），0.1 mg/mL的1－羟基萘标液50.0 m L（相当于加入1－羟基萘5.0 m g）。1－羟基芘的测定结果为 34.53ng/mL。标准加入的1－羟基芘的回收率为98.51%。
    从实验结果可以看出：对于标准加入的1－羟基芘具有较好的回收率，且在2.5m g/mL的1－羟基萘的背景下对1-羟基芘的测定结果影响很小，可见所建立的方法是可靠的。
2.4 鲈鱼胆汁中的1－羟基芘的分析
    从实验结果（见图4）可以看出：当实验组未外加芘时，其胆汁中的1－羟基芘的含量无显著性差异（空白对照组的鲈鱼胆汁中的1－羟基芘的含量为2.27 mg/mL，丙酮对照组的鲈鱼胆汁中的1－羟基芘的含量为2.25 ug/mL）；同时可以看出所使用的沙滤海水受到了芘的轻微污染。各组之间的1－羟基芘的含量与外加于水环境中的芘的含量呈显著相关性（相关系数为：0.9995），这提示可以运用胆汁中的1－羟基芘的含量来指示水体中的芘的污染水平。同时可以看出，当水体中的芘浓度达到10.0 mg/L (即49.5 ´ 10^-9 mol/L )时，胆汁中的1－羟基芘的含量达到110.3 mg/mL (505 ´ 10^-6 mol/L)，放大倍数达到1万倍；可见鲈鱼对水体中的芘具有很强的富集和代谢能力，也同时表明：可以通过测定鲈鱼胆汁中的1－羟基芘的水平可以很灵敏地检测出水体受到芘的污染程度。

图4 鲈鱼胆汁中1－羟基芘含量的分析

致谢：本文在实验过程中得到厦门大学化学系林竹光老师和李小波老师的指导和帮助，特此表示衷心的感谢！

REFERENCES
[1] Escartin E, Porte C. Marine Pollution Bulletin, 1999, 38 (12): 1200-1206.
[2] Hong Huasheng, Wang Xinhong, Xu Li et al.  J. Environ. Sci. Health, 2000, A35 (10): 1833-1847.
[3] Zhou J L, Hong H, Zhang Z et al. China. Wat. Res., 2000, 34 (7): 2132-2150.
[4] Pavanello S, Clonfero E. Mutation Research, 2000, 463: 285-308.
[5] Aas E, Baussant T, Balk L et al. Aquatic Toxicology, 2000, 51: 241-258.
[6] Hong Huasheng, Lin Jianqing, Wang Xinhong et al. Chemical Journal on Internet, 2002, 4 (2): 7.
[7] Sole M. Trends in analytical chemistry, 2000, 19 (1): 1-9.

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